※ 引述《yashi (我要天天快乐快乐)》之铭言： : ※ 引述《yashi (我要天天快乐快乐)》之铭言： : : 我是把real-time PCR做完的产物拿来跑电泳 : : 取15μL的sample加上3μl的dye : : 这次跑出来的sample是β-actin 大小大概是60bp : : PCR跑了40个cycle : : 胶片是1%的agrose gel : : buffer都是1× TBE buffer : : 我之前也是照着这个条件跑 : : 都有跑出结果来 : : 不过最近几次发现sample都卡在上面下不来… : : 但是marker却分得满漂亮的 : : 现在根本不知道问题出在哪里 : : 觉得很苦恼… : : 希望板上有高手可以帮我解决 : : 感激不尽！！！ : : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=yashihuang&b=17&f=1299448889&p=3 昨天看到已经很晚了 所以到现在才回 : 先谢谢很多人愿意帮我一起厘清问题 : 其实我个人比较倾向是buffer或是sample的问题哎 同s大表示 如果是这些问题 你的marker不会那麽清楚 : 因为我这个实验重覆满多次了 : 条件都是一样的 1%的胶100V跑40min : 不过之前都没有这方面的问题 : 而且这次的sample是real-time完的产物 : 而我同时也有跑melting curve : melting是一个很漂亮的peak 这我没有做很多 不确定real-time侦测到的萤光 比实际的"specific" PCR product是不是绝对正确 也不知道是不是这原因 你们老师才要求你要跑GE 但是gel图看起来 不知道是背景 还是non-specific 的smear : 我p完的产物放在-20℃冰箱三天我就跑了 : PCR的program也不太可能有人动到… : 因为我们实验室就只有我疯狂的在跑real-time PCR : agrose我也都用一样的 : 附带一题 : 我的这个照片是用 切胶片用的光箱+数位相机+滤镜照出来的 : 所以可能照片跟照胶器照出来的 品质会差很多0rz... : 还有我不太了解 所谓的well里面卡住的是template DNA是什麽意思…？？ : 是代表我的template DNA加太多 所以反应不完全吗？ 我会说template DNA卡在那边 因为看你的marker应该是100bp-3k的吧 所以上面残留的大小 应该是template DNA才对 然後看染色的结果 相对来说 背景那麽强 只有60bp的 band一定会看不到 另外 你的gel只有1% 以往我们要分50-500bp的band都用到3%的gel 或是 5%的 poly-acrylamide gel 1%跑 60bp 跑到下面都糊掉了(你可以看marker的100bp) 片段又很小很难染色 所以什麽都看不到 : 如果是这样的话可以从real-time PCR的curve或是melting curve看出来吗？ : (我觉得如果template DNA很多的话 melting curve应该会很丑吧？？？) : 最後 谢谢大家努力帮我解决！！ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 203.64.80.49