※ 引述《yashi (我要天天快樂快樂)》之銘言： : 標題: Re: [求救] DNA電泳 : 時間: Wed Jul 22 00:06:07 2009 : : ※ 引述《yashi (我要天天快樂快樂)》之銘言： : : 我是把real-time PCR做完的產物拿來跑電泳 : : 取15μL的sample加上3μl的dye : : 這次跑出來的sample是β-actin 大小大概是60bp : : PCR跑了40個cycle : : 膠片是1%的agrose gel : : buffer都是1× TBE buffer : : 我之前也是照著這個條件跑 : : 都有跑出結果來 : : 不過最近幾次發現sample都卡在上面下不來… : : 但是marker卻分得滿漂亮的 : : 現在根本不知道問題出在哪裡 : : 覺得很苦惱… : : 希望板上有高手可以幫我解決 : : 感激不盡！！！ : : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=yashihuang&b=17&f=1299448889&p=3 : 先謝謝很多人願意幫我一起釐清問題 : 其實我個人比較傾向是buffer或是sample的問題哎 : 因為我這個實驗重覆滿多次了 : 條件都是一樣的 1%的膠100V跑40min : 不過之前都沒有這方面的問題 : 而且這次的sample是real-time完的產物 : 而我同時也有跑melting curve : melting是一個很漂亮的peak : 我p完的產物放在-20℃冰箱三天我就跑了 : PCR的program也不太可能有人動到… : 因為我們實驗室就只有我瘋狂的在跑real-time PCR : agrose我也都用一樣的 : 附帶一題 : 我的這個照片是用 切膠片用的光箱+數位相機+濾鏡照出來的 : 所以可能照片跟照膠器照出來的 品質會差很多0rz... : 還有我不太了解 所謂的well裡面卡住的是template DNA是什麼意思…？？ : 是代表我的template DNA加太多 所以反應不完全嗎？ : 如果是這樣的話可以從real-time PCR的curve或是melting curve看出來嗎？ : (我覺得如果template DNA很多的話 melting curve應該會很醜吧？？？) : 最後 謝謝大家努力幫我解決！！ : : -- :

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) : ◆ From: 61.229.148.140 : 推 seal0413:If your buffer has problem, your marker won't be 07/22 05:45 : → seal0413:showed clear. 07/22 05:49 : → seal0413:Maybe you should check your PCR reagent 07/22 06:11 : → seal0413:If PCR is ok, you will try real-time PCR!!! 07/22 06:13 ^^^^^^^^^^^^^^ 有點不了解s大說的意思 因為我的系統就是real-time PCR 只是老師想再跑膠而check size : → bobbygau:經過Melting curve後，dsDNA全被打開，很短時間內降溫， 07/22 11:06 : → bobbygau:常常會亂黏而造成smear。我覺得可以不用跑膠了，不然就 07/22 11:08 : 真的假的………… ps我們老師一直逼我 → bobbygau:別做melting curve。SYBR Safe/Green染小片段效果不佳， 07/22 11:09 : → bobbygau:試試EtBr。 07/22 11:10 ？？？ 聽不太懂b大的意思哎？？？ 我跑膠的染劑是用Genomics公司出的HealthView Nucleic Stain 它號稱可以替代EtBr...... 但比較不毒.... 謝謝大家 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.23.86