作者yashi (我要天天快樂快樂)
看板Biotech
標題Re: [求救] DNA電泳
時間Wed Jul 22 00:06:07 2009
※ 引述《yashi (我要天天快樂快樂)》之銘言：
: 我是把real-time PCR做完的產物拿來跑電泳
: 取15μL的sample加上3μl的dye
: 這次跑出來的sample是β-actin 大小大概是60bp
: PCR跑了40個cycle
: 膠片是1%的agrose gel
: buffer都是1× TBE buffer
: 我之前也是照著這個條件跑
: 都有跑出結果來
: 不過最近幾次發現sample都卡在上面下不來…
: 但是marker卻分得滿漂亮的
: 現在根本不知道問題出在哪裡
: 覺得很苦惱…
: 希望板上有高手可以幫我解決
: 感激不盡！！！
: http://www.wretch.cc/album/show.php?i=yashihuang&b=17&f=1299448889&p=3
先謝謝很多人願意幫我一起釐清問題
其實我個人比較傾向是buffer或是sample的問題哎
因為我這個實驗重覆滿多次了
條件都是一樣的 1%的膠100V跑40min
不過之前都沒有這方面的問題
而且這次的sample是real-time完的產物
而我同時也有跑melting curve
melting是一個很漂亮的peak
我p完的產物放在-20℃冰箱三天我就跑了
PCR的program也不太可能有人動到…
因為我們實驗室就只有我瘋狂的在跑real-time PCR
agrose我也都用一樣的
附帶一題
我的這個照片是用 切膠片用的光箱+數位相機+濾鏡照出來的
所以可能照片跟照膠器照出來的 品質會差很多0rz...
還有我不太了解 所謂的well裡面卡住的是template DNA是什麼意思…？？
是代表我的template DNA加太多 所以反應不完全嗎？
如果是這樣的話可以從real-time PCR的curve或是melting curve看出來嗎？
(我覺得如果template DNA很多的話 melting curve應該會很醜吧？？？)
最後 謝謝大家努力幫我解決！！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.229.148.140
1F：推 seal0413:If your buffer has problem, your marker won't be 07/22 05:45
2F：→ seal0413:showed clear. 07/22 05:49
3F：→ seal0413:Maybe you should check your PCR reagent 07/22 06:11
4F：→ seal0413:If PCR is ok, you will try real-time PCR!!! 07/22 06:13
5F：→ bobbygau:經過Melting curve後，dsDNA全被打開，很短時間內降溫， 07/22 11:06
6F：→ bobbygau:常常會亂黏而造成smear。我覺得可以不用跑膠了，不然就 07/22 11:08
7F：→ bobbygau:別做melting curve。SYBR Safe/Green染小片段效果不佳， 07/22 11:09
8F：→ bobbygau:試試EtBr。 07/22 11:10