作者pytforyou ()
看板Biotech
標題[求救] Western 的 band 被擠壓到
時間Wed Jul 15 12:01:15 2009
大家好
我最近做的 Western Blotting
Band 都會被擠壓到
而且大都在中間區域的位置
不論是大分子量或是小分子量
我們實驗室從做膠到 transfer 都是用 Bio-Rad 的系統
圖片：
http://www.wretch.cc/album/album.php?id=popopaul34&book=5
這張圖我秀的算是大分子量的位置
大約是在 55kDa 的位置
同一張 Blot 大約 25kDa 的位置
也有相同的情形發生
但是更為嚴重一些
(24kDa 那邊從 lane 2 到 lane 7
都是一樣的狀況)
我想問的問題是
在 lane 4 和 lane 5 的位置
發生了什麼事情？
我跟實驗室的人討論過
有人覺得是大泡泡的影響
有人覺得是被擠壓到
我個人覺得不是泡泡
因為我在做 transfer 的時候
都很仔細的看
而且我也有請別人幫我確定有沒有泡泡
所以我覺得應該不是泡泡的影響
不過擠壓到的話
我也覺得怪怪的
因為我都挑很鬆的那種 transfer casette
我一定不會硬擠進去
另外
我問過一個 sales
她說有可能是膠沒做好
她說有可能是因為膠凝的太快
而且膠做的不均勻
於是我按照板上其他大大的做法
APS 和 TEMED 的比例為 10:1
全部配好之後
我用 droper 加到玻璃裡面
大約要等 30 分鐘才會凝固
以上是 Resolving gel (下膠)的部份
(我覺得膠做的還滿漂亮的
因為下膠和上膠中間的那條線很直
不過純屬感覺)
我們實驗室其他人做
大都不會遇到這樣的問題
不過我個人遇到這樣的問題機率很高
基本上每次做兩片就至少一片會有這樣的狀況
昨天做四片有三片都這樣
而這樣的問題困擾我許久了
因此想問問看大家的意見
看看是否能夠改善
麻煩大家幫我想想了
如果有任何需要的資訊
只要在不損害實驗室權利的狀況下
我將不吝提供
感謝各位了
以方便板友幫您追蹤問題
----請將上列注意事項以
ctrl + k 刪除後開始編輯文章----
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.208.45
1F：→ bluerstars:你loading時有卡膠的情形嗎?well有殘膠嗎? 07/16 12:28
2F：推 tchan:仔細看沒有泡泡，不代表真的沒有，這很明顯是泡泡壓到 07/16 13:18
3F：→ pytforyou:我在loading的時候沒有發生卡膠的情形！ 07/16 15:49
4F：→ pytforyou:請問二樓大大，那如何確認在做transfer時沒有泡泡呢？ 07/16 16:46
5F：推 su9602:transfer完用ponceau S 染一下! 07/16 20:14
6F：推 evergreen215:這看起來比較像transfer溫度不均造成的問題 07/16 22:11
7F：→ evergreen215:建議可將tank放到冰桶裡,或是加一個小stir bar進去 07/16 22:12
8F：→ evergreen215:膠沒凝好的問題只有在target band接近最底下才會 07/16 22:16
9F：→ evergreen215:bio-rad的濕式系統這種狀況遇過好幾次 算是小毛病吧 07/16 22:18
10F：→ pytforyou:下次做transfer的時候，我會試試看加一個stir bar 07/17 02:05
11F：→ pytforyou:謝謝你的建議！ 07/17 02:06
12F：推 alaric:SDS-PAGE 用CBR染看看, 可能某個蛋白超量了吧... 07/19 01:10