作者pytforyou ()
看板Biotech
标题[求救] Western 的 band 被挤压到
时间Wed Jul 15 12:01:15 2009
大家好
我最近做的 Western Blotting
Band 都会被挤压到
而且大都在中间区域的位置
不论是大分子量或是小分子量
我们实验室从做胶到 transfer 都是用 Bio-Rad 的系统
图片：
http://www.wretch.cc/album/album.php?id=popopaul34&book=5
这张图我秀的算是大分子量的位置
大约是在 55kDa 的位置
同一张 Blot 大约 25kDa 的位置
也有相同的情形发生
但是更为严重一些
(24kDa 那边从 lane 2 到 lane 7
都是一样的状况)
我想问的问题是
在 lane 4 和 lane 5 的位置
发生了什麽事情？
我跟实验室的人讨论过
有人觉得是大泡泡的影响
有人觉得是被挤压到
我个人觉得不是泡泡
因为我在做 transfer 的时候
都很仔细的看
而且我也有请别人帮我确定有没有泡泡
所以我觉得应该不是泡泡的影响
不过挤压到的话
我也觉得怪怪的
因为我都挑很松的那种 transfer casette
我一定不会硬挤进去
另外
我问过一个 sales
她说有可能是胶没做好
她说有可能是因为胶凝的太快
而且胶做的不均匀
於是我按照板上其他大大的做法
APS 和 TEMED 的比例为 10:1
全部配好之後
我用 droper 加到玻璃里面
大约要等 30 分钟才会凝固
以上是 Resolving gel (下胶)的部份
(我觉得胶做的还满漂亮的
因为下胶和上胶中间的那条线很直
不过纯属感觉)
我们实验室其他人做
大都不会遇到这样的问题
不过我个人遇到这样的问题机率很高
基本上每次做两片就至少一片会有这样的状况
昨天做四片有三片都这样
而这样的问题困扰我许久了
因此想问问看大家的意见
看看是否能够改善
麻烦大家帮我想想了
如果有任何需要的资讯
只要在不损害实验室权利的状况下
我将不吝提供
感谢各位了
以方便板友帮您追踪问题
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◆ From: 140.120.208.45
1F：→ bluerstars:你loading时有卡胶的情形吗?well有残胶吗? 07/16 12:28
2F：推 tchan:仔细看没有泡泡，不代表真的没有，这很明显是泡泡压到 07/16 13:18
3F：→ pytforyou:我在loading的时候没有发生卡胶的情形！ 07/16 15:49
4F：→ pytforyou:请问二楼大大，那如何确认在做transfer时没有泡泡呢？ 07/16 16:46
5F：推 su9602:transfer完用ponceau S 染一下! 07/16 20:14
6F：推 evergreen215:这看起来比较像transfer温度不均造成的问题 07/16 22:11
7F：→ evergreen215:建议可将tank放到冰桶里,或是加一个小stir bar进去 07/16 22:12
8F：→ evergreen215:胶没凝好的问题只有在target band接近最底下才会 07/16 22:16
9F：→ evergreen215:bio-rad的湿式系统这种状况遇过好几次 算是小毛病吧 07/16 22:18
10F：→ pytforyou:下次做transfer的时候，我会试试看加一个stir bar 07/17 02:05
11F：→ pytforyou:谢谢你的建议！ 07/17 02:06
12F：推 alaric:SDS-PAGE 用CBR染看看, 可能某个蛋白超量了吧... 07/19 01:10