作者abbyyam (ㄟ逼)
看板Biotech
標題[求救] Western internal control 老是搞不定
時間Wed Jul 1 15:22:36 2009
各位日安
最近做western遇到個怪問題
就是有某一株細胞的internal control老是標很高(很黑的意思)
但是在做western 之前我已經有測過濃度了
也都調成一樣的量我才denature跟load gel的
但是不知道為什麼他的internal control就是非常黑
b-actin 跟 GAPGH都一樣
並且transfer完染膠看protein 量也都差不多
甚至我把protein少load 了一些相對起來還是一樣比較強
而且少load protein後無論是由染膠或是從membrane的一些雜band看
都發現的確protein都有明顯的比較少
這樣即使我故意把protein量調很少讓他internal control一樣多
其他target protein的量表現多還少我都不太敢相信了...
到底該怎麼解決這問題呢???
麻煩大家了> <
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.247.100
1F：→ lssunti:抗體太強? 07/01 15:45
似乎不是，和另一細胞株(HT1376)有瞞明顯的差異(有疑問的cel line是RT4)
另外補充一下他是和我其他sample同一類型和organ的cancer cell line
都是human的，不同的地方應一個是從男生來的一個從女生來的 (有差嗎?= =")
還有這兩株癌細胞的grade不同
大致上是如此
※ 編輯: abbyyam 來自: 203.64.247.100 (07/01 17:09)
2F：→ blence:你的internal control是b-actin,GAPDH? 反正你都定量了,如 07/01 18:31
3F：→ blence:果還需要control,不見得要這些常用的,例如你看癌化,可以拿 07/01 18:33
4F：→ blence:免疫,膜蛋白,代謝相關,或隔壁實驗室不同領域的抗體都可試試 07/01 18:34
5F：→ blence:或者某支Ab常會出現的non-specific band也行,不用太堅持 07/01 18:39
6F：推 cocoon121:有沒有可能 該系包經由刺激後 反而不能用一般的當? 07/02 01:28
7F：→ cocoon121:我看過有人報告過 某細胞因為怎樣的處理後 GAPDH不準 07/02 01:28
8F：→ cocoon121:然後必須要用到TUBULIN才可以 (抗體名稱是舉例) 07/02 01:29
9F：→ abbyyam:好的~感謝大家的意見~我先換種抗體試試!! 07/02 13:56