作者SPK (雲淡風輕)
看板Biotech
標題Re: [求救] western blot 全黑
時間Tue Jun 30 23:38:00 2009
※ 引述《linwei (我會好好加油^^)》之銘言：
: 哈 我再說清楚一點齁@@
: 步驟是
: 1. transfer 完的 membrane 用 5% 牛奶blocking 1.5 h
: 2. 倒掉牛奶 加入 1抗 (用blocking 溶液 1:1000稀釋泡成的)
: 3. 4度C overnight後 又 37度C 1hr
: 4. wash 30min (每10min換一次新的1 x TBST)
: 5. 加入2抗 搖 1hr
: 6. wash (同4)
: 7 加ECL 壓片
: 我在想可能是我一抗不需要再搖37度C了齁
: 再稀釋然後4度C overnight就好了齁@@!!
37℃ 1hr + 4℃ O/N~~~~~不知道你清不清楚這些動作的目的……有點亂搞一通~~
37℃是為了弱bend而以加溫來加速加強一抗的作用通常都以分鐘數來計時的~~~，
4℃ O/N是為了不要讓一抗亂認才以降溫來讓它慢慢反應~
一般來說一抗就直接室溫（25℃）反應1~2hr即可，如果為了讓bend漂亮、背景乾淨有人會
用4℃ O/N，但時間會拖很久~然後！他們4℃ O/N拿出來後“頂多“也只在“室溫“再滾
個半小時左右。就洗掉換二抗了。
然後你的一抗1:1000不知道是有人作過還是抗體說明書建議的，這個要try過才知道，然後
你三次wash也沒錯我之前都是洗四次最後一次十五分鐘，不知道你的轉速如何？
: ※ 引述《linwei (我會好好加油^^)》之銘言：
: : 謝謝大家的建議
: : 我稀釋的比例是 1:1000
: : 然後是用5%的牛奶泡成的抗體(同時也是我們的blocking溶液)
: : 抗體是新泡的 (因為我是跟我同學要原液回來泡的喔)
: : 然後只做一次(就是全亮的這一次@@")
: : 我想我會再稀釋我的一抗的濃度
: : 譬如說我原本泡的有10c.c
: : 我想我會先取2c.c.出來，再加2c.c的牛奶再對半稀釋
: : 然後再試試看
: : 謝謝大家的熱心建議 :)
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◆ From: 60.198.73.170
1F：推 tsubasawolfy:1:1000是datasheet寫的 另外我覺得轉速差不到哪去XD 06/30 23:42
2F：→ tsubasawolfy:200rpm不會比60rpm乾淨 不過死水般的10rpm是有影響 06/30 23:43
3F：推 bluecsky:多換幾次buffer比轉速快慢有用多了 個人感覺.. 07/01 00:39
4F：→ bluecsky:除非慢到誇張啦 不然buffer多換還比較好 只是就很浪費XD 07/01 00:40
5F：推 sultan:挑個錯 是band 不是 bend 07/01 10:00