作者SPK (云淡风轻)
看板Biotech
标题Re: [求救] western blot 全黑
时间Tue Jun 30 23:38:00 2009
※ 引述《linwei (我会好好加油^^)》之铭言：
: 哈 我再说清楚一点齁@@
: 步骤是
: 1. transfer 完的 membrane 用 5% 牛奶blocking 1.5 h
: 2. 倒掉牛奶 加入 1抗 (用blocking 溶液 1:1000稀释泡成的)
: 3. 4度C overnight後 又 37度C 1hr
: 4. wash 30min (每10min换一次新的1 x TBST)
: 5. 加入2抗 摇 1hr
: 6. wash (同4)
: 7 加ECL 压片
: 我在想可能是我一抗不需要再摇37度C了齁
: 再稀释然後4度C overnight就好了齁@@!!
37℃ 1hr + 4℃ O/N~~~~~不知道你清不清楚这些动作的目的……有点乱搞一通~~
37℃是为了弱bend而以加温来加速加强一抗的作用通常都以分钟数来计时的~~~，
4℃ O/N是为了不要让一抗乱认才以降温来让它慢慢反应~
一般来说一抗就直接室温（25℃）反应1~2hr即可，如果为了让bend漂亮、背景乾净有人会
用4℃ O/N，但时间会拖很久~然後！他们4℃ O/N拿出来後“顶多“也只在“室温“再滚
个半小时左右。就洗掉换二抗了。
然後你的一抗1:1000不知道是有人作过还是抗体说明书建议的，这个要try过才知道，然後
你三次wash也没错我之前都是洗四次最後一次十五分钟，不知道你的转速如何？
: ※ 引述《linwei (我会好好加油^^)》之铭言：
: : 谢谢大家的建议
: : 我稀释的比例是 1:1000
: : 然後是用5%的牛奶泡成的抗体(同时也是我们的blocking溶液)
: : 抗体是新泡的 (因为我是跟我同学要原液回来泡的喔)
: : 然後只做一次(就是全亮的这一次@@")
: : 我想我会再稀释我的一抗的浓度
: : 譬如说我原本泡的有10c.c
: : 我想我会先取2c.c.出来，再加2c.c的牛奶再对半稀释
: : 然後再试试看
: : 谢谢大家的热心建议 :)
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◆ From: 60.198.73.170
1F：推 tsubasawolfy:1:1000是datasheet写的 另外我觉得转速差不到哪去XD 06/30 23:42
2F：→ tsubasawolfy:200rpm不会比60rpm乾净 不过死水般的10rpm是有影响 06/30 23:43
3F：推 bluecsky:多换几次buffer比转速快慢有用多了 个人感觉.. 07/01 00:39
4F：→ bluecsky:除非慢到夸张啦 不然buffer多换还比较好 只是就很浪费XD 07/01 00:40
5F：推 sultan:挑个错 是band 不是 bend 07/01 10:00