作者bbiioo (梅子)
看板Biotech
標題[求救] 西方墨點測試蛋白的合成
時間Sun Jun 28 11:59:06 2009
我是將所要的(從染色體DNA PCR來的)基因接在一表現載體上用大腸桿菌表現其蛋白
將純化到的蛋白打老鼠收集多株抗體
收到的血清進行西方墨點法!
抗體的效價 稀釋至1/2000 還可以有很明顯的 辨認效果
現在我要直接將這抗體 辨認直接取自(真菌) 菌體培養後產生的蛋白
理論上 應該可以辨認到 但是沒有
因為我有另再從RNA去進行RT-PCR 也可以得到同樣的基因片段
DNA會轉錄成RNA 那應該也會合成出蛋白質
還是說 不一定??
麻煩大家幫我解答一下囉!謝謝
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◆ From: 140.130.38.65
1F：推 zoom8080:接cDNA比較正確吧... 06/28 12:36
喔!我的策略是有各別從染色體DNA及cDNA進行基因選殖..
2F：推 turtle24:第一行是用什麼系統表現蛋白去免疫老鼠? 06/28 13:06
大腸桿菌表達的!!
3F：推 afunafun:你當初打老鼠前的蛋白怎麼純化的 06/28 14:42
4F：→ afunafun:難道跟你後面用菌表現的不一樣 06/28 14:42
5F：→ afunafun:最後你可以用菌表現的蛋白 去做抗體 06/28 14:43
打老鼠的蛋白是從大腸桿菌表現後用His-tag 管柱純化，
去辨認同樣表現自大腸桿菌的蛋白可以辨認到 但去表現本身真菌的蛋白認不到
6F：推 littlelizard:測titer和你最後western要用得應該是同一種才對吧 06/28 19:20
7F：推 littlelizard:假設你先用酵母菌表現的去免疫 後來用E.coli表現 06/28 19:23
8F：→ littlelizard:然後你的蛋白又需要轉譯後修飾 那就可能認不到啦 06/28 19:24
恩~我是剛好反過來 我是用E.coli表現的蛋白去免疫 ，去辨認真菌的蛋白
表現系統不一樣 了解會有認不到的可能性
可是我cDNA可以得到相同的片段..應該可說是 此基因會進行轉錄
※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (06/30 10:02)
※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (06/30 10:05)
9F：推 littlelizard:會轉錄和轉譯後修飾是兩回事吧? 假設說這是個醣蛋白 06/30 16:44
10F：→ littlelizard:你用E.coli表現他的folding就不對了 之後真菌表現的 06/30 16:44
11F：→ littlelizard:有醣基化的話 可能就把你原本會辨識的epitope蓋住了 06/30 16:45
12F：推 littlelizard:拿你的胺基酸序列去預測一下epitope和轉譯後修飾位置 06/30 16:49
13F：→ bbiioo:..恩~了解 那再問一下..要預測 可以去哪測?(網站) 07/01 00:24
14F：→ bbiioo:還是說 我手上有DNA Star這套軟體 他可以作這預測嗎?謝謝 07/01 00:24