作者bbiioo (梅子)
看板Biotech
标题[求救] 西方墨点测试蛋白的合成
时间Sun Jun 28 11:59:06 2009
我是将所要的(从染色体DNA PCR来的)基因接在一表现载体上用大肠杆菌表现其蛋白
将纯化到的蛋白打老鼠收集多株抗体
收到的血清进行西方墨点法!
抗体的效价 稀释至1/2000 还可以有很明显的 辨认效果
现在我要直接将这抗体 辨认直接取自(真菌) 菌体培养後产生的蛋白
理论上 应该可以辨认到 但是没有
因为我有另再从RNA去进行RT-PCR 也可以得到同样的基因片段
DNA会转录成RNA 那应该也会合成出蛋白质
还是说 不一定??
麻烦大家帮我解答一下罗!谢谢
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◆ From: 140.130.38.65
1F：推 zoom8080:接cDNA比较正确吧... 06/28 12:36
喔!我的策略是有各别从染色体DNA及cDNA进行基因选殖..
2F：推 turtle24:第一行是用什麽系统表现蛋白去免疫老鼠? 06/28 13:06
大肠杆菌表达的!!
3F：推 afunafun:你当初打老鼠前的蛋白怎麽纯化的 06/28 14:42
4F：→ afunafun:难道跟你後面用菌表现的不一样 06/28 14:42
5F：→ afunafun:最後你可以用菌表现的蛋白 去做抗体 06/28 14:43
打老鼠的蛋白是从大肠杆菌表现後用His-tag 管柱纯化，
去辨认同样表现自大肠杆菌的蛋白可以辨认到 但去表现本身真菌的蛋白认不到
6F：推 littlelizard:测titer和你最後western要用得应该是同一种才对吧 06/28 19:20
7F：推 littlelizard:假设你先用酵母菌表现的去免疫 後来用E.coli表现 06/28 19:23
8F：→ littlelizard:然後你的蛋白又需要转译後修饰 那就可能认不到啦 06/28 19:24
恩~我是刚好反过来 我是用E.coli表现的蛋白去免疫 ，去辨认真菌的蛋白
表现系统不一样 了解会有认不到的可能性
可是我cDNA可以得到相同的片段..应该可说是 此基因会进行转录
※ 编辑: bbiioo 来自: 140.130.38.65 (06/30 10:02)
※ 编辑: bbiioo 来自: 140.130.38.65 (06/30 10:05)
9F：推 littlelizard:会转录和转译後修饰是两回事吧? 假设说这是个醣蛋白 06/30 16:44
10F：→ littlelizard:你用E.coli表现他的folding就不对了 之後真菌表现的 06/30 16:44
11F：→ littlelizard:有醣基化的话 可能就把你原本会辨识的epitope盖住了 06/30 16:45
12F：推 littlelizard:拿你的胺基酸序列去预测一下epitope和转译後修饰位置 06/30 16:49
13F：→ bbiioo:..恩~了解 那再问一下..要预测 可以去哪测?(网站) 07/01 00:24
14F：→ bbiioo:还是说 我手上有DNA Star这套软体 他可以作这预测吗?谢谢 07/01 00:24