作者hdf87ery (hdf87ery)
看板Biotech
標題[討論]請問哪個e.coli strain比較不會自己剪切plasmid?
時間Tue Jun 23 19:27:48 2009
事情是這樣的
我construct一個大約１４.5kb左右的plasmid transformt到DH5a後挑出
第一天養個幾cc做確認時沒有發現任何雜plasmid
第二天,拿一點第一天菌做subculture後抽plasmid發現會出現雜plasmid
1.拿第二天的菌做streak,可以分離出我要的plasmid跟雜plasmid
分離出的菌再經過第1天的培養確認,沒再出現雜plasmid,但再養第二天時
那雜plasmid就又出現了
2.雜plasmid切出來的BAND都與前一天結果一樣,但我沒個別分離出來抽plasmid確認,
只是與我要的plasmid混在一起看的,能辦認出的酵素除了single cut外
只有另外二個酵素
許多酵素切出來的長度幾乎是重合的,但是如果經過第三天的培養後
可看出一些低bp的BAND會比高bp的BAND還亮
所以我想有可能是菌自己剔掉的
這部份是否有可能?
3.有用plasmid另外transform一次,但結果跟streak一樣
4.LB方面應該沒汙染,人為操作方面就不太確定了
5.假如我推測沒錯的話,有哪些strain比較不會剔plasmid呢?
我的construct有PGK,Neomycin,polyA,SV40polyA,rabbit B-globin polyA
loxP,我的基因,其他genome序列,
6.還有哪些情況會導致我這結果發生?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.98.94
1F：推 tsubasawolfy:有沒有可能是序列跟DH5A chromosome相近造成一些 06/23 20:08
2F：→ tsubasawolfy:repair system或者RE相近也作用在上面? 06/23 20:08
3F：推 jsi:plasmid較大時常見這種剪接現象 我是重新設計construct只保留 06/23 22:36
4F：→ jsi:必須要的部份 盡量讓plasmid小於10K 不知是否有人可提供如何養 06/23 22:38
5F：→ jsi:超大plasmid的訣竅呢? 06/23 22:39
6F：推 blence:有篇paper要clone一個10kb的gene就用STBL2這個strain,而且 06/23 23:25
7F：→ blence:除了跟invitrogen買，台灣還有一些lab保留 06/23 23:26
8F：推 williamyang:我現在用STBL3,效果還不錯. 06/23 23:52
9F：推 yaliu:可以問一下嗎？為什麼菌會剔掉plasmid?DH5a不是已經把一些 06/24 02:24
10F：→ yaliu:基因做突變了嗎？recA endA之類的，不是應該可以穩定保存 06/24 02:26
11F：→ yaliu:質體？？？ 06/24 02:26
12F：推 rimeni:養在30度而不要養在37度~ 06/24 11:53