作者hdf87ery (hdf87ery)
看板Biotech
标题[讨论]请问哪个e.coli strain比较不会自己剪切plasmid?
时间Tue Jun 23 19:27:48 2009
事情是这样的
我construct一个大约１４.5kb左右的plasmid transformt到DH5a後挑出
第一天养个几cc做确认时没有发现任何杂plasmid
第二天,拿一点第一天菌做subculture後抽plasmid发现会出现杂plasmid
1.拿第二天的菌做streak,可以分离出我要的plasmid跟杂plasmid
分离出的菌再经过第1天的培养确认,没再出现杂plasmid,但再养第二天时
那杂plasmid就又出现了
2.杂plasmid切出来的BAND都与前一天结果一样,但我没个别分离出来抽plasmid确认,
只是与我要的plasmid混在一起看的,能办认出的酵素除了single cut外
只有另外二个酵素
许多酵素切出来的长度几乎是重合的,但是如果经过第三天的培养後
可看出一些低bp的BAND会比高bp的BAND还亮
所以我想有可能是菌自己剔掉的
这部份是否有可能?
3.有用plasmid另外transform一次,但结果跟streak一样
4.LB方面应该没污染,人为操作方面就不太确定了
5.假如我推测没错的话,有哪些strain比较不会剔plasmid呢?
我的construct有PGK,Neomycin,polyA,SV40polyA,rabbit B-globin polyA
loxP,我的基因,其他genome序列,
6.还有哪些情况会导致我这结果发生?
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.98.94
1F：推 tsubasawolfy:有没有可能是序列跟DH5A chromosome相近造成一些 06/23 20:08
2F：→ tsubasawolfy:repair system或者RE相近也作用在上面? 06/23 20:08
3F：推 jsi:plasmid较大时常见这种剪接现象 我是重新设计construct只保留 06/23 22:36
4F：→ jsi:必须要的部份 尽量让plasmid小於10K 不知是否有人可提供如何养 06/23 22:38
5F：→ jsi:超大plasmid的诀窍呢? 06/23 22:39
6F：推 blence:有篇paper要clone一个10kb的gene就用STBL2这个strain,而且 06/23 23:25
7F：→ blence:除了跟invitrogen买，台湾还有一些lab保留 06/23 23:26
8F：推 williamyang:我现在用STBL3,效果还不错. 06/23 23:52
9F：推 yaliu:可以问一下吗？为什麽菌会剔掉plasmid?DH5a不是已经把一些 06/24 02:24
10F：→ yaliu:基因做突变了吗？recA endA之类的，不是应该可以稳定保存 06/24 02:26
11F：→ yaliu:质体？？？ 06/24 02:26
12F：推 rimeni:养在30度而不要养在37度~ 06/24 11:53