作者soceress (贏了世界又如何)
看板Biotech
標題[求救] 請教Western blot的問題
時間Fri Jun 12 22:31:00 2009
1.page的配方與running buffer,transfer buffer的關係
以前的實驗室的gel用的是molecular cloning裡的配方
(30% acrylamide,1.5M pH8.8 Tris-HCl,SDS,APS,TEMED..這是下膠)
running buffer:含SDS的Tris-Glycine
transfer buffer:含SDS,Tris,Glycine,MeOH 20%
現在這個實驗室用的是
30% acrylamide,3.0M pH8.8 Tris-HCl,40% glycerol,APS, TEMED
running buffer:含SDS的Tris-Tricine
transfer buffer:不含SDS,其餘同上
膠的配方主要差在SDS和glycerol
請問這兩種膠的用途有什麼不同呢??
如果上面的膠配上下面的transfer buffer會不會transfer效率變差??
如果上面的膠配上下面的running buffer會不會有問題?? (比方說膠過燙)
我要跑的是60~70KD的蛋白質
2.transfer的條件如果改變會影響data趨勢嗎??
用含SDS與不含SDS的transfer buffer,趨勢會不同嗎??
目前學姐們有三種條件(大家用的都不一樣^^||),要看的仍是60~70KD的蛋白質
a. 120V transfer 1.5hr
b. 100V transfer 1.5hr
c. 50V transfer 4hr
自己是覺得應該不會改變趨勢...
我一直習慣用b,做出來和一年前剛到新實驗室用a的結果相反......n=4,三重覆
於是試著用c,趨勢和b一樣
3.同一個sample同時load跑四片
染了同一個抗體,理論上4片的target protein都可以染得很清楚(這是已經確定的)
結果固定某個檢體,兩片有(明顯),兩片沒有(定量結果為0)
聽別人說可能是power supply在transfer過程中短路
還有沒有別的可能呢??
感謝各位耐心看完~~~
先謝謝大家的幫忙~~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.165.222.94
1F：推 tsubasawolfy:如果你手上有molecular cloning的話可以翻看看 06/12 23:00
2F：→ tsubasawolfy:Glyserol是沒看到寫差異 SDS在transfer那段就有寫 06/12 23:00
3F：→ tsubasawolfy:60-70kD依我有加SDS跟沒加SDS差別接近零 06/12 23:01
4F：→ tsubasawolfy:伏特高低只是會縮短或增加時間 當然buffer變熱速度 06/12 23:03
5F：→ tsubasawolfy:也有影響 過熱trnasfer出來的就真的很難看一.一 06/12 23:04
6F：→ tsubasawolfy:另外第三點是不是把用一次transfer 4片的tank XD? 06/12 23:06
7F：→ soceress:對,一次transfer 4片的tank~ 謝謝你的回應~我去翻翻書~ 06/12 23:10
8F：推 tsubasawolfy:根據某I大牌的Handbook 每transfer一片要多10%MeOH 06/12 23:12
9F：→ tsubasawolfy:不過因為用的tank因素(最多2片) 沒試過真的假的=3= 06/12 23:13
10F：→ soceress:哇..那不是幾乎快一半都是MeOH XDDDD 06/12 23:26
11F：→ soceress:不過我用transfer兩片的tank x2 做4片,還是會2片有2片無 06/12 23:27
12F：→ soceress:真不知該怎麼辦好...T_T 06/12 23:29
13F：→ tsubasawolfy:那這樣沒道理 四片膠都染的到但兩片有兩片沒有 06/13 06:11
14F：推 NKTcell:你的power supply是同一台嗎? 建議不要用同一台... 06/14 02:04