作者soceress (赢了世界又如何)
看板Biotech
标题[求救] 请教Western blot的问题
时间Fri Jun 12 22:31:00 2009
1.page的配方与running buffer,transfer buffer的关系
以前的实验室的gel用的是molecular cloning里的配方
(30% acrylamide,1.5M pH8.8 Tris-HCl,SDS,APS,TEMED..这是下胶)
running buffer:含SDS的Tris-Glycine
transfer buffer:含SDS,Tris,Glycine,MeOH 20%
现在这个实验室用的是
30% acrylamide,3.0M pH8.8 Tris-HCl,40% glycerol,APS, TEMED
running buffer:含SDS的Tris-Tricine
transfer buffer:不含SDS,其余同上
胶的配方主要差在SDS和glycerol
请问这两种胶的用途有什麽不同呢??
如果上面的胶配上下面的transfer buffer会不会transfer效率变差??
如果上面的胶配上下面的running buffer会不会有问题?? (比方说胶过烫)
我要跑的是60~70KD的蛋白质
2.transfer的条件如果改变会影响data趋势吗??
用含SDS与不含SDS的transfer buffer,趋势会不同吗??
目前学姐们有三种条件(大家用的都不一样^^||),要看的仍是60~70KD的蛋白质
a. 120V transfer 1.5hr
b. 100V transfer 1.5hr
c. 50V transfer 4hr
自己是觉得应该不会改变趋势...
我一直习惯用b,做出来和一年前刚到新实验室用a的结果相反......n=4,三重覆
於是试着用c,趋势和b一样
3.同一个sample同时load跑四片
染了同一个抗体,理论上4片的target protein都可以染得很清楚(这是已经确定的)
结果固定某个检体,两片有(明显),两片没有(定量结果为0)
听别人说可能是power supply在transfer过程中短路
还有没有别的可能呢??
感谢各位耐心看完~~~
先谢谢大家的帮忙~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 118.165.222.94
1F：推 tsubasawolfy:如果你手上有molecular cloning的话可以翻看看 06/12 23:00
2F：→ tsubasawolfy:Glyserol是没看到写差异 SDS在transfer那段就有写 06/12 23:00
3F：→ tsubasawolfy:60-70kD依我有加SDS跟没加SDS差别接近零 06/12 23:01
4F：→ tsubasawolfy:伏特高低只是会缩短或增加时间 当然buffer变热速度 06/12 23:03
5F：→ tsubasawolfy:也有影响 过热trnasfer出来的就真的很难看一.一 06/12 23:04
6F：→ tsubasawolfy:另外第三点是不是把用一次transfer 4片的tank XD? 06/12 23:06
7F：→ soceress:对,一次transfer 4片的tank~ 谢谢你的回应~我去翻翻书~ 06/12 23:10
8F：推 tsubasawolfy:根据某I大牌的Handbook 每transfer一片要多10%MeOH 06/12 23:12
9F：→ tsubasawolfy:不过因为用的tank因素(最多2片) 没试过真的假的=3= 06/12 23:13
10F：→ soceress:哇..那不是几乎快一半都是MeOH XDDDD 06/12 23:26
11F：→ soceress:不过我用transfer两片的tank x2 做4片,还是会2片有2片无 06/12 23:27
12F：→ soceress:真不知该怎麽办好...T_T 06/12 23:29
13F：→ tsubasawolfy:那这样没道理 四片胶都染的到但两片有两片没有 06/13 06:11
14F：推 NKTcell:你的power supply是同一台吗? 建议不要用同一台... 06/14 02:04