我想我自己找到問題了 如果破菌不完全 則蛋白質量不夠 detergent phase 密度不夠重就無法自原先的溶液中被分離出來 因此要改進的話最好以freeze and thaw或是 french press等物理性破菌的方式於實驗前對細菌進行破菌 ※ 引述《pocession (阿宗)》之銘言： : 我是以Triton X 114 partitioning來進行membrane protein extraction的實驗 : 但在執行上出了一些問題 : 想請問大家一下 : 這方法的原理大致上是這樣的， : 首先將細菌懸浮在含有1% triton x 114的buffer中， : 並且置於冰上使蛋白質溶解於buffer， : 接著離心去除細胞殘渣， : 然後轉移至高溫(>30度)， : Triton series detergent在較高的溫度時， : 水溶性會降低， : detergent會自行聚合， : 接著再以離心的方式， : 將溶液分成aqeuos phase和detergnet phase， : deterent phase因密度較重，會出現於管中的下層， : 而此時membrane protein就會溶於下層detergent phase。 : 但是在操作上出了一些問題： : 首先我的實驗對象是Mycoplasma fermentans， : 但是我以buffer懸浮它時，並以離心去除不溶的沉澱物時， : 發現含有1% triton x 114 buffer並無法對菌體產生破菌 : 而有大量的沉澱物出現 : 而這個問題似乎影響了之後蛋白質萃取的量 : 請問這樣的現象正常嗎? : 如果我懷疑菌沒破， : 是否應該在實驗開始前引入破菌的步驟(free and thaw，sonication等) : 第二個是我照著protocol上講解的操作， : 發現分層並不明顯，因此我改用較高比例的triton X 114進行實驗 : 分層現象雖然明顯 : 但卻造成detergent phase中triton x 114的比例太高， : 於SDS PAGE分析時影響蛋白質在膠中的移動， : 可是幾乎所有的protocol都是寫1% tx114， : 請問1% TX114會太少嗎?為什麼我沒辦法分層呢? : 第三個問題則是有些PROTOCOL上寫要以swinging bucket rotor來進行離心 : 不過由於我沒有這種設備，因此我僅使用一般桌上型的離心機來進行離心 : 請問這樣的離心會對分層產生影響嗎? --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.77.155