我想我自己找到问题了 如果破菌不完全 则蛋白质量不够 detergent phase 密度不够重就无法自原先的溶液中被分离出来 因此要改进的话最好以freeze and thaw或是 french press等物理性破菌的方式於实验前对细菌进行破菌 ※ 引述《pocession (阿宗)》之铭言： : 我是以Triton X 114 partitioning来进行membrane protein extraction的实验 : 但在执行上出了一些问题 : 想请问大家一下 : 这方法的原理大致上是这样的， : 首先将细菌悬浮在含有1% triton x 114的buffer中， : 并且置於冰上使蛋白质溶解於buffer， : 接着离心去除细胞残渣， : 然後转移至高温(>30度)， : Triton series detergent在较高的温度时， : 水溶性会降低， : detergent会自行聚合， : 接着再以离心的方式， : 将溶液分成aqeuos phase和detergnet phase， : deterent phase因密度较重，会出现於管中的下层， : 而此时membrane protein就会溶於下层detergent phase。 : 但是在操作上出了一些问题： : 首先我的实验对象是Mycoplasma fermentans， : 但是我以buffer悬浮它时，并以离心去除不溶的沉淀物时， : 发现含有1% triton x 114 buffer并无法对菌体产生破菌 : 而有大量的沉淀物出现 : 而这个问题似乎影响了之後蛋白质萃取的量 : 请问这样的现象正常吗? : 如果我怀疑菌没破， : 是否应该在实验开始前引入破菌的步骤(free and thaw，sonication等) : 第二个是我照着protocol上讲解的操作， : 发现分层并不明显，因此我改用较高比例的triton X 114进行实验 : 分层现象虽然明显 : 但却造成detergent phase中triton x 114的比例太高， : 於SDS PAGE分析时影响蛋白质在胶中的移动， : 可是几乎所有的protocol都是写1% tx114， : 请问1% TX114会太少吗?为什麽我没办法分层呢? : 第三个问题则是有些PROTOCOL上写要以swinging bucket rotor来进行离心 : 不过由於我没有这种设备，因此我仅使用一般桌上型的离心机来进行离心 : 请问这样的离心会对分层产生影响吗? --

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