※ 引述《yaliu (雅)》之銘言： : ※ 引述《captdavince (走自己的路)》之銘言： : : 各位好 : : 不好意思.. : : 是一個課業上的問題..但是是星期五結束的討論.很想要知道各位是怎麼做的 : : 還請各位包涵 : : 我們拿到一張sequence定序的圖.還有wild type的sequence，應該是patient的sample : : 然後是已知有問題的sequence，然後就是要我們找到位置.。然後看混淆的sequence : : 定序區，然後identify是那一種mutation : : 定序用的方法應該是sangers sequencing : : 主要就是混淆的sequence中眼睛看確認那個地方是什麼polymorphism然後再比對 : : 1.請問一下..如果我這樣做，我怎麼知道那個mutant是從那一股的DNA定到的? : : 當時實驗課很趕，所以我只稍微問了一下助教，助教是說一跟wild type比就知道 : : 我實際用DNAMAN比一比是把跟wild type比較像的放到同一股上 : : 但是這樣不是會有一個問題：在不知道是什麼mutation, inversion, deletion, : : insertion的情況下，怎麼知道定序上兩個peak代表的nucleotide是在那一股上? 我解釋一下 定序的圖為leukemia病人的cancer cell DNA進行PCR後 未經過cloning直接做定序的結果 你所拿到的應是屬於single allele mutation(heterozygous)的情形 因此定序結果會看到從mutation site開始, 後面的序列都會有兩個顏色的peak重疊的情形 其中一個代表wild allele, 另一個代表mutant allele 但是因為不知道重疊的兩個peak哪一個是屬於wild allele, 哪一個是mutant allele 所以要根據發給你的wild sequence, 去找出屬於wild allele的訊號 這樣剩下的另一種就是mutant allele的訊號了 : : 2.在看sequence時，大家都是全部輸進電腦裡做multiple alignment然後看嗎? : : 還是說都用眼睛看呢? 如果是經過cloning後定序的結果, 或是確定只有一種PCR amplicon(or sequence)的結果 才適合用電腦做alignment (定序結果通常會另外附上.txt檔) 像這次的題目是不適合的 : : 3.一些mutation像是deletion, addition或site mutation可以在multiple alignment : : 後看得出來，但是像是inversion, frameshift等mutation : : 有algorithm可以看得出來嗎? : : 基本上定序完後，廠商會給兩個檔案 : : 一個是看訊號的強度，一個是訂完的nucleotide序列 : : 我們通常都是將序列輸入倒NCBI進行blast就可以知道 : : 你比對到的相似物種序列，以及方向 : : : 當然如果你已知序列的功能或來自的物種，並且有WT的序列 : : 只想知道這兩個序列差異 : : 也可以利用NCBI上面的bl2seq比對一下就可以知道了 : : 什麼樣子的突變就可以知道了，用肉眼看太困難了 : : : 4.另外一個有關定序的問題想要問一下，在爬文之後發現就是一般要定序都會做TA : : cloning : : 像這種時候送定序就直接送嗎?不需要給廠商vector的種類跟做cloning用的切位嗎? : : 送定序看你送什麼樣子的樣本 : : 可以送菌（必須告訴廠商host及抗生素抗性、質體） : : 也可以送質體（當然要講是哪種質體） : : 切位不用講 : : : 好像有些情況也是PCR product確定是single band後也可以定序 : : 像這兩種，如果廠商不需要vector的種類，或只是PCR product : : 要怎麼選primer呢?如何才能定到? : : 也可以送PCR產物（要確定是single band），不需講vector種類 : : : 送定序除了給sample之外，最重要的是要說以什麼primer定序 : : 如果是廠商有的primer不用附給他們 : : 但如果是自己合成的primer就必須附給廠商 : : 並且告知廠商primer濃度及黏合溫度 : : primer就送你PCR用的primer即可 以上y大說的沒錯..感謝補充～ : : 謝謝各位 如果還有問題歡迎一起討論～ PS. 我是助教 XD --

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