※ 引述《yaliu (雅)》之铭言： : ※ 引述《captdavince (走自己的路)》之铭言： : : 各位好 : : 不好意思.. : : 是一个课业上的问题..但是是星期五结束的讨论.很想要知道各位是怎麽做的 : : 还请各位包涵 : : 我们拿到一张sequence定序的图.还有wild type的sequence，应该是patient的sample : : 然後是已知有问题的sequence，然後就是要我们找到位置.。然後看混淆的sequence : : 定序区，然後identify是那一种mutation : : 定序用的方法应该是sangers sequencing : : 主要就是混淆的sequence中眼睛看确认那个地方是什麽polymorphism然後再比对 : : 1.请问一下..如果我这样做，我怎麽知道那个mutant是从那一股的DNA定到的? : : 当时实验课很赶，所以我只稍微问了一下助教，助教是说一跟wild type比就知道 : : 我实际用DNAMAN比一比是把跟wild type比较像的放到同一股上 : : 但是这样不是会有一个问题：在不知道是什麽mutation, inversion, deletion, : : insertion的情况下，怎麽知道定序上两个peak代表的nucleotide是在那一股上? 我解释一下 定序的图为leukemia病人的cancer cell DNA进行PCR後 未经过cloning直接做定序的结果 你所拿到的应是属於single allele mutation(heterozygous)的情形 因此定序结果会看到从mutation site开始, 後面的序列都会有两个颜色的peak重叠的情形 其中一个代表wild allele, 另一个代表mutant allele 但是因为不知道重叠的两个peak哪一个是属於wild allele, 哪一个是mutant allele 所以要根据发给你的wild sequence, 去找出属於wild allele的讯号 这样剩下的另一种就是mutant allele的讯号了 : : 2.在看sequence时，大家都是全部输进电脑里做multiple alignment然後看吗? : : 还是说都用眼睛看呢? 如果是经过cloning後定序的结果, 或是确定只有一种PCR amplicon(or sequence)的结果 才适合用电脑做alignment (定序结果通常会另外附上.txt档) 像这次的题目是不适合的 : : 3.一些mutation像是deletion, addition或site mutation可以在multiple alignment : : 後看得出来，但是像是inversion, frameshift等mutation : : 有algorithm可以看得出来吗? : : 基本上定序完後，厂商会给两个档案 : : 一个是看讯号的强度，一个是订完的nucleotide序列 : : 我们通常都是将序列输入倒NCBI进行blast就可以知道 : : 你比对到的相似物种序列，以及方向 : : : 当然如果你已知序列的功能或来自的物种，并且有WT的序列 : : 只想知道这两个序列差异 : : 也可以利用NCBI上面的bl2seq比对一下就可以知道了 : : 什麽样子的突变就可以知道了，用肉眼看太困难了 : : : 4.另外一个有关定序的问题想要问一下，在爬文之後发现就是一般要定序都会做TA : : cloning : : 像这种时候送定序就直接送吗?不需要给厂商vector的种类跟做cloning用的切位吗? : : 送定序看你送什麽样子的样本 : : 可以送菌（必须告诉厂商host及抗生素抗性、质体） : : 也可以送质体（当然要讲是哪种质体） : : 切位不用讲 : : : 好像有些情况也是PCR product确定是single band後也可以定序 : : 像这两种，如果厂商不需要vector的种类，或只是PCR product : : 要怎麽选primer呢?如何才能定到? : : 也可以送PCR产物（要确定是single band），不需讲vector种类 : : : 送定序除了给sample之外，最重要的是要说以什麽primer定序 : : 如果是厂商有的primer不用附给他们 : : 但如果是自己合成的primer就必须附给厂商 : : 并且告知厂商primer浓度及黏合温度 : : primer就送你PCR用的primer即可 以上y大说的没错..感谢补充～ : : 谢谢各位 如果还有问题欢迎一起讨论～ PS. 我是助教 XD --

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