作者cbeta (只缺一個石敢當)
看板Biotech
標題[求救] 關於cloning
時間Thu Jun 4 15:35:32 2009
我的實驗是將RNA轉成cDNA後進行qPCR做基因表現的定量；在cloning的部份，之前在整理
材料與方法時，發現我以前的作法是RT-PCR反轉錄成cDNA後進行PCR，將PCR產物集合後
做clean up，之後直接進行ligation。
後來換到另一個實驗室，助理學姊反而不建議我做clean up，她的方法是cDNA進行PCR，
然後跑電泳膠，切膠進行gel extraction，產物再進行ligation。
而我去詢問她為什麼非得用gel extraction的時候，學姊的回答是因為確認反應為單一
產物。
但我不明白的是，在clean up之前，我也同樣有跑電泳確認，結果都是單一產物只有
一條band，既然如此，進行clean up 與 gel extraction有什麼差別呢？
我覺得gel extraction做出來的效率未必比clean up高，想問問有做過cloning的版友們，
在這個步驟中，gel extraction除了能純化出PCR產物外，是否有其他更重要的作用呢ꄊ
這個問題感覺很基本，但是我實在不敢去問情緒起伏較大的學姊orz
懇請版友們指引我個方向吧，感激不盡～T///T
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◆ From: 210.243.44.57
1F：推 conective:有時候膠看不到 不代表沒有其他BAND 只是保險吧 06/04 15:45
2F：→ conective:其實做的出來才是重點 06/04 15:47
3F：推 sheepfeather:我接TA為了保險起見也是做Gel extraction 06/04 15:48
4F：推 raxjimmy:我也是做Gel extraction 不過我想知道clean up是怎麼做的 06/04 16:02
5F：推 dankai:同一二樓! 我比較喜歡使用gel extraction~呵~成功率很高! 06/04 16:03
6F：→ cbeta:喔喔！很感謝版友們回覆，我大概知道了，謝謝大家！ 06/04 16:16
7F：→ cbeta:我以前做clean up是用GeneMark的clean up kit，做法我貼網址 06/04 16:18
9F：→ cbeta:另外一問，大家所說gel extraction的成功率，是指之後是否有 06/04 16:20
10F：→ cbeta:clon到自己所要的片段嗎？要如何看回收的效率呢？謝謝～ 06/04 16:21
11F：推 dankai:回收率的話就是再跑個膠就知道了~但通常我都直接接了! 06/04 16:38
12F：推 tsubasawolfy:genemark那套回收率大概90%~50% 看切gel的技術而定 06/04 16:49
13F：→ conective:成功率 其實就是最後你有做出你要的clone 06/04 16:51
14F：→ conective:回收率即使差一點 ligation夠用就好了 看insert大小而定 06/04 16:51
15F：→ conective:作膠體回收主要是最保險 06/04 16:52
16F：→ cbeta:嗯嗯，真的非常感謝大家，尤其是c大，謝謝你的解答！>///< 06/04 17:00
17F：推 NKTcell:兩者都可以呀~ 沒有說一定要用哪個 兩個都做的出來唷~ 06/04 20:56
18F：→ NKTcell:差別的話就是clean up可能會有你看不到的片段~ 06/04 20:57
19F：→ NKTcell:不過如果band很sharp的話~我會選clean up 06/04 20:58
20F：→ NKTcell:gel extraction 多少都要接觸到UV 還可能接觸到EtBr 06/04 20:59
21F：→ NKTcell:gel extraction 可以較準確的回收到預期片段~ 06/04 21:00
22F：→ NKTcell:但在major band的周圍可能也有其他 你看不見的雜band 06/04 21:01
23F：→ NKTcell:這兩個方法都有回收率的問題存在~ 06/04 21:02
24F：→ NKTcell:總而言之~ 看情況而定 & 個人喜好吧~ 做的出來就好 06/04 21:02
25F：→ cbeta:嗯嗯，也謝謝N大的回應，很詳細！謝謝=////= 06/06 23:13