作者cbeta (只缺一个石敢当)
看板Biotech
标题[求救] 关於cloning
时间Thu Jun 4 15:35:32 2009
我的实验是将RNA转成cDNA後进行qPCR做基因表现的定量；在cloning的部份，之前在整理
材料与方法时，发现我以前的作法是RT-PCR反转录成cDNA後进行PCR，将PCR产物集合後
做clean up，之後直接进行ligation。
後来换到另一个实验室，助理学姊反而不建议我做clean up，她的方法是cDNA进行PCR，
然後跑电泳胶，切胶进行gel extraction，产物再进行ligation。
而我去询问她为什麽非得用gel extraction的时候，学姊的回答是因为确认反应为单一
产物。
但我不明白的是，在clean up之前，我也同样有跑电泳确认，结果都是单一产物只有
一条band，既然如此，进行clean up 与 gel extraction有什麽差别呢？
我觉得gel extraction做出来的效率未必比clean up高，想问问有做过cloning的版友们，
在这个步骤中，gel extraction除了能纯化出PCR产物外，是否有其他更重要的作用呢ꄊ
这个问题感觉很基本，但是我实在不敢去问情绪起伏较大的学姊orz
恳请版友们指引我个方向吧，感激不尽～T///T
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◆ From: 210.243.44.57
1F：推 conective:有时候胶看不到 不代表没有其他BAND 只是保险吧 06/04 15:45
2F：→ conective:其实做的出来才是重点 06/04 15:47
3F：推 sheepfeather:我接TA为了保险起见也是做Gel extraction 06/04 15:48
4F：推 raxjimmy:我也是做Gel extraction 不过我想知道clean up是怎麽做的 06/04 16:02
5F：推 dankai:同一二楼! 我比较喜欢使用gel extraction~呵~成功率很高! 06/04 16:03
6F：→ cbeta:喔喔！很感谢版友们回覆，我大概知道了，谢谢大家！ 06/04 16:16
7F：→ cbeta:我以前做clean up是用GeneMark的clean up kit，做法我贴网址 06/04 16:18
9F：→ cbeta:另外一问，大家所说gel extraction的成功率，是指之後是否有 06/04 16:20
10F：→ cbeta:clon到自己所要的片段吗？要如何看回收的效率呢？谢谢～ 06/04 16:21
11F：推 dankai:回收率的话就是再跑个胶就知道了~但通常我都直接接了! 06/04 16:38
12F：推 tsubasawolfy:genemark那套回收率大概90%~50% 看切gel的技术而定 06/04 16:49
13F：→ conective:成功率 其实就是最後你有做出你要的clone 06/04 16:51
14F：→ conective:回收率即使差一点 ligation够用就好了 看insert大小而定 06/04 16:51
15F：→ conective:作胶体回收主要是最保险 06/04 16:52
16F：→ cbeta:嗯嗯，真的非常感谢大家，尤其是c大，谢谢你的解答！>///< 06/04 17:00
17F：推 NKTcell:两者都可以呀~ 没有说一定要用哪个 两个都做的出来唷~ 06/04 20:56
18F：→ NKTcell:差别的话就是clean up可能会有你看不到的片段~ 06/04 20:57
19F：→ NKTcell:不过如果band很sharp的话~我会选clean up 06/04 20:58
20F：→ NKTcell:gel extraction 多少都要接触到UV 还可能接触到EtBr 06/04 20:59
21F：→ NKTcell:gel extraction 可以较准确的回收到预期片段~ 06/04 21:00
22F：→ NKTcell:但在major band的周围可能也有其他 你看不见的杂band 06/04 21:01
23F：→ NKTcell:这两个方法都有回收率的问题存在~ 06/04 21:02
24F：→ NKTcell:总而言之~ 看情况而定 & 个人喜好吧~ 做的出来就好 06/04 21:02
25F：→ cbeta:嗯嗯，也谢谢N大的回应，很详细！谢谢=////= 06/06 23:13