作者FUSION87 (一起企都都轟阿)
看板Biotech
標題[求救] PCR primer 設計
時間Fri May 29 17:52:20 2009
請問各位先進
小弟遇到了一個問題
排除掉操作上的錯誤以外，個人認為似乎是primer設計上錯了...
我所使用的RE是NdeI(NEB) & XhoI (Roche)，buffer是Roche的Buffer H
再切Vector的時候都沒什麼問題，切Insert(PCR product)也看不出來有什麼問題。
只是ligation一直失敗，完全沒接進去。
後來曾經在板上查到說PCR primer上RE site外的EXTENSION sequence的部份要注意
小弟這邊是都設計四個Mer "ATAT"去給RE binding
不過在NEB的網頁中查到的資料
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)
http://0rz.tw/gcIFJ
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)
http://0rz.tw/0f2em
這兩個網頁不知道差在哪邊??
似乎NdeI 需要7個Mer以上去給NdeI binding
不知道這樣推論對不對呢??
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.136.49.221
※ 編輯: FUSION87 來自: 220.136.49.221 (05/29 17:52)
1F：推 soom:如果方便的話做個TA cloning吧 05/29 17:55
2F：推 nzj:推TA cloning不會多花多少時間 比你卡在那裡好 05/29 20:11
3F：推 chvkimo:第2個連結是 中華武術? 05/29 22:25
4F：推 hannvei:摔跤協會 05/29 23:53
抱歉 以改正 縮網址的時候打錯
5F：推 SugarSa:既然您說切的時候沒問題，為啥又要看這個幾個mer的東西呢 05/30 00:20
6F：→ SugarSa:vector先切一刀，再CIP，再切另一刀，再CIP，這樣再去接 05/30 00:22
我的意思是說 切vector都沒什麼問題，有看到片段掉下來
不過pcr product就切的前後想說只掉幾個mer，也看不出個所以然來...
※ 編輯: FUSION87 來自: 220.136.65.227 (05/30 00:55)
7F：推 SugarSa:這樣的話接TA之後也是會遇到同樣的問題，好像沒有比較好 05/30 02:00
8F：推 SugarSa:不對，我想錯了，接上TA後，RE就有很多mer可以黏上去 05/30 02:03
9F：→ SugarSa:這樣理論上就切的動了 05/30 02:03
10F：推 duest:你有做CIP嗎 之前用HindIII設計忘記加flanking還是成功 05/30 02:48
11F：→ duest:ligation的時後多加個vector當control 05/30 02:48
12F：→ duest:比較colony數就大概知道有沒有切成功了 05/30 02:49
13F：→ duest:打錯 多加個vector alone 05/30 02:50
14F：推 SugarSa:我也覺得關鍵是CIP 05/30 02:53
15F：→ FUSION87:有做CIAP 不過其實還是會有self ligation的狀況出現.. 05/30 13:46
16F：→ FUSION87:如果使用commercial competent cells的話 就一顆都不長.. 05/30 14:00
17F：→ FUSION87:感謝 最後用TA接完了^^ 07/01 21:42