作者FUSION87 (一起企都都轰阿)
看板Biotech
标题[求救] PCR primer 设计
时间Fri May 29 17:52:20 2009
请问各位先进
小弟遇到了一个问题
排除掉操作上的错误以外，个人认为似乎是primer设计上错了...
我所使用的RE是NdeI(NEB) & XhoI (Roche)，buffer是Roche的Buffer H
再切Vector的时候都没什麽问题，切Insert(PCR product)也看不出来有什麽问题。
只是ligation一直失败，完全没接进去。
後来曾经在板上查到说PCR primer上RE site外的EXTENSION sequence的部份要注意
小弟这边是都设计四个Mer "ATAT"去给RE binding
不过在NEB的网页中查到的资料
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)
http://0rz.tw/gcIFJ
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)
http://0rz.tw/0f2em
这两个网页不知道差在哪边??
似乎NdeI 需要7个Mer以上去给NdeI binding
不知道这样推论对不对呢??
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.136.49.221
※ 编辑: FUSION87 来自: 220.136.49.221 (05/29 17:52)
1F：推 soom:如果方便的话做个TA cloning吧 05/29 17:55
2F：推 nzj:推TA cloning不会多花多少时间 比你卡在那里好 05/29 20:11
3F：推 chvkimo:第2个连结是 中华武术? 05/29 22:25
4F：推 hannvei:摔跤协会 05/29 23:53
抱歉 以改正 缩网址的时候打错
5F：推 SugarSa:既然您说切的时候没问题，为啥又要看这个几个mer的东西呢 05/30 00:20
6F：→ SugarSa:vector先切一刀，再CIP，再切另一刀，再CIP，这样再去接 05/30 00:22
我的意思是说 切vector都没什麽问题，有看到片段掉下来
不过pcr product就切的前後想说只掉几个mer，也看不出个所以然来...
※ 编辑: FUSION87 来自: 220.136.65.227 (05/30 00:55)
7F：推 SugarSa:这样的话接TA之後也是会遇到同样的问题，好像没有比较好 05/30 02:00
8F：推 SugarSa:不对，我想错了，接上TA後，RE就有很多mer可以黏上去 05/30 02:03
9F：→ SugarSa:这样理论上就切的动了 05/30 02:03
10F：推 duest:你有做CIP吗 之前用HindIII设计忘记加flanking还是成功 05/30 02:48
11F：→ duest:ligation的时後多加个vector当control 05/30 02:48
12F：→ duest:比较colony数就大概知道有没有切成功了 05/30 02:49
13F：→ duest:打错 多加个vector alone 05/30 02:50
14F：推 SugarSa:我也觉得关键是CIP 05/30 02:53
15F：→ FUSION87:有做CIAP 不过其实还是会有self ligation的状况出现.. 05/30 13:46
16F：→ FUSION87:如果使用commercial competent cells的话 就一颗都不长.. 05/30 14:00
17F：→ FUSION87:感谢 最後用TA接完了^^ 07/01 21:42