作者wind90257 (企圖X野心X實力-我是小龜)
看板Biotech
標題[求救] 用ＰＣＲ求得一段未知片段 其結果皆為smear
時間Wed May 27 14:39:50 2009
如題
genomic DNA濃度為0.08ug/ul 取250ul
1.一開始先用restriction enzyme處理 genomic DNA後，蒐集感興趣的片段（約2kb）
做phenol/chloroform處理後，用12ul 二次水回溶，用全部體積下去做self-ligation，
overnight。
2. DNA（ligation 產物）
10X PCR buffer 1X
Primer 1 0.2uM
Primer 2 0.2uM
Taq 2U
Dntp 0.2mM
二次水
Total 20ul
Primer Tm值為51℃，長度皆為20mer，無GC-rich。
PCR condition：
1. 94 2min
2. 51 2min
3. 72 2min
4. 94 1min
5. 51 1min
6. 72 2min
7. 30cycles
8. 72 5min
此次PCR結果為product 1，取部份product 1做第二次PCR，之後使用另外一組primer
（Primer Tm值為51℃，長度皆為20mer，無GC-rich），同樣的condition，其PCR結
果為product 2
3.跑0.8％ gel（有negative control）
結果：
negative control為預期結果
product 1 smear
product 2 smear
我想要的是一個band啊> <
請問有何解決之道
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是誰在... ▃▄▄▄ 哀家的 |\\ // | ◣ \\ //
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◆ From: 134.208.24.95
※ 編輯: wind90257 來自: 134.208.24.95 (05/27 14:46)
1F：推 enisx:template DNA用多少?? smear大多不出template太濃, primer太 05/27 21:22
2F：→ enisx:濃, 或是anneal溫度太低; 另外PCR program為何要跑兩種時間? 05/27 21:23
3F：推 kemp6611:那個PCR的溫度怎這麼奇怪??為啥要設計溫度梯度變化? 05/31 14:40
4F：→ kemp6611:2kb的size,anneal時間1.5min就很足夠了~ 05/31 14:41