作者wind90257 (企图X野心X实力-我是小龟)
看板Biotech
标题[求救] 用ＰＣＲ求得一段未知片段 其结果皆为smear
时间Wed May 27 14:39:50 2009
如题
genomic DNA浓度为0.08ug/ul 取250ul
1.一开始先用restriction enzyme处理 genomic DNA後，蒐集感兴趣的片段（约2kb）
做phenol/chloroform处理後，用12ul 二次水回溶，用全部体积下去做self-ligation，
overnight。
2. DNA（ligation 产物）
10X PCR buffer 1X
Primer 1 0.2uM
Primer 2 0.2uM
Taq 2U
Dntp 0.2mM
二次水
Total 20ul
Primer Tm值为51℃，长度皆为20mer，无GC-rich。
PCR condition：
1. 94 2min
2. 51 2min
3. 72 2min
4. 94 1min
5. 51 1min
6. 72 2min
7. 30cycles
8. 72 5min
此次PCR结果为product 1，取部份product 1做第二次PCR，之後使用另外一组primer
（Primer Tm值为51℃，长度皆为20mer，无GC-rich），同样的condition，其PCR结
果为product 2
3.跑0.8％ gel（有negative control）
结果：
negative control为预期结果
product 1 smear
product 2 smear
我想要的是一个band啊> <
请问有何解决之道
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是谁在... ▃▄▄▄ 哀家的 |\\ // | ◣ \\ //
▃ ▄ 通路上..| ﹨┌ / | ◥ 小海豹！ //
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◆ From: 134.208.24.95
※ 编辑: wind90257 来自: 134.208.24.95 (05/27 14:46)
1F：推 enisx:template DNA用多少?? smear大多不出template太浓, primer太 05/27 21:22
2F：→ enisx:浓, 或是anneal温度太低; 另外PCR program为何要跑两种时间? 05/27 21:23
3F：推 kemp6611:那个PCR的温度怎这麽奇怪??为啥要设计温度梯度变化? 05/31 14:40
4F：→ kemp6611:2kb的size,anneal时间1.5min就很足够了~ 05/31 14:41