作者mimique (分手後才真正的認識你)
看板Biotech
標題Re: [求救] clone 問題~vector會自黏
時間Mon May 25 17:40:26 2009
借標題問一下
最近我也遇到很類似的情況
ligation之後 都是self ligation
一開始是懷疑insert 沒切好
後來是懷疑plasmid沒抽好 所以切的時候有問題
所以後來有做check
我的plasmid大概7.5kb
用兩個RE (SalI&NotI) 各切一刀 之後 和沒有切的plasmid跑電泳比較
結果~~怪事發生了!!!
沒有切的就是supercoli form 大概在marker 7~8之間
但是各切一刀的 分子量竟然變成9~10之間
雖然很想懷疑是沒跑下來 但是因為marker都有跑開 分的很清楚 應該不是膠的問題
所以現在轉向是buffer的問題
但NEB的buffer應該品質很穩定吧?而且我是拿新的來做
遇到這個問題該怎麼解決????????
還有請問大家
遇到RE doule digestion的時候 要用不同buffer的時候會怎麼做?
我一直以來都是用clean up的方式去換buffer 就是最後用要換的那個buffer elute出來
但最近不知道為什麼 見鬼的一直切不動
後來是用補NaCl和Tris的方法 才切動
這我真的很不了解 到底在eppendof中是發生什麼事了@ @
※ 引述《afunafun (afunafun)》之銘言：
: 建議vector 作RE取的濃度不要太高 還有切完記得跑膠 看有無切開
: 原po說vector會切下的片段很小無法分辨
: 其實很簡單 跑1%的gel 分別load有切跟沒切的
: 有切開的會變成直線 所以大小應該跟原始質體大小一樣
: 至於沒切的質體依然是環狀 跑膠會跑比較快
: 藉由兩者比較很容易分辨 RE有沒有切得很成功
: PS. 兩個RE site切開後 確定不會互黏 就不需要做CIP了
: 我自己都不做 因為省時間
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◆ From: 202.169.162.125
1F：推 ranilla:linear form比較上面不是很合理嗎？ 05/25 18:14
2F：推 dennisag:我是覺得你的vector上應該有接上什麼東西.. 05/25 18:39
3F：→ dennisag:所以size已經不是你預期的7.5Kb了 05/25 18:39
4F：推 bluecsky:supercoil form跑得比linear form低不是很正常嗎XD 05/25 19:02
5F：→ bluecsky:你的問題是在於為何應該掉一段insert出來卻沒掉嗎? 05/25 19:03
6F：→ bluecsky:而且plasmid 7.5k直接跑的話應該會比7k還低歐 05/25 19:03
7F：→ bluecsky:最有可能就是你拿到的map跟你的plasmid不合 05/25 19:04
8F：→ bluecsky:所以你的plasmid已經有修改過了 可能接過什麼東西 05/25 19:04
9F：推 conective:要不要去定序看看 05/25 19:27
10F：推 yaliu:感覺是plasmid發生問題，切一刀怎麼可能比原來的大... 05/25 20:01
11F：推 tsubasawolfy:NEB的double digestion有一張buffer表 05/25 20:11
12F：→ tsubasawolfy:上面寫要作seq的在分開做sequential就好 05/25 20:12
14F：→ mimique:plasmid是買來的 (novagen) 買來就transform 05/25 22:16
15F：→ mimique:本身是空的 應該沒問題 只是因為construct有問題才會check 05/25 22:17
16F：→ mimique:就算linear form會比較高 但應該也不會大於本來分子量吧 05/25 22:18
17F：→ mimique:前面問的是novagen買來的plasmid的情況 下面double 05/25 22:19
18F：→ mimique:digestion用的是另一個實驗室裡已經有接insert的plasmid 05/25 22:19
19F：→ mimique:怎麼切都切不出insert 後來補文中提的東西才切動@ @ 05/25 22:20
20F：推 FinAPP:現在要切的切位有沒有因為之前的clone動到了,RE不能辨識了? 05/25 22:42