作者mimique (分手後才真正的认识你)
看板Biotech
标题Re: [求救] clone 问题~vector会自黏
时间Mon May 25 17:40:26 2009
借标题问一下
最近我也遇到很类似的情况
ligation之後 都是self ligation
一开始是怀疑insert 没切好
後来是怀疑plasmid没抽好 所以切的时候有问题
所以後来有做check
我的plasmid大概7.5kb
用两个RE (SalI&NotI) 各切一刀 之後 和没有切的plasmid跑电泳比较
结果~~怪事发生了!!!
没有切的就是supercoli form 大概在marker 7~8之间
但是各切一刀的 分子量竟然变成9~10之间
虽然很想怀疑是没跑下来 但是因为marker都有跑开 分的很清楚 应该不是胶的问题
所以现在转向是buffer的问题
但NEB的buffer应该品质很稳定吧?而且我是拿新的来做
遇到这个问题该怎麽解决????????
还有请问大家
遇到RE doule digestion的时候 要用不同buffer的时候会怎麽做?
我一直以来都是用clean up的方式去换buffer 就是最後用要换的那个buffer elute出来
但最近不知道为什麽 见鬼的一直切不动
後来是用补NaCl和Tris的方法 才切动
这我真的很不了解 到底在eppendof中是发生什麽事了@ @
※ 引述《afunafun (afunafun)》之铭言：
: 建议vector 作RE取的浓度不要太高 还有切完记得跑胶 看有无切开
: 原po说vector会切下的片段很小无法分辨
: 其实很简单 跑1%的gel 分别load有切跟没切的
: 有切开的会变成直线 所以大小应该跟原始质体大小一样
: 至於没切的质体依然是环状 跑胶会跑比较快
: 藉由两者比较很容易分辨 RE有没有切得很成功
: PS. 两个RE site切开後 确定不会互黏 就不需要做CIP了
: 我自己都不做 因为省时间
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 202.169.162.125
1F：推 ranilla:linear form比较上面不是很合理吗？ 05/25 18:14
2F：推 dennisag:我是觉得你的vector上应该有接上什麽东西.. 05/25 18:39
3F：→ dennisag:所以size已经不是你预期的7.5Kb了 05/25 18:39
4F：推 bluecsky:supercoil form跑得比linear form低不是很正常吗XD 05/25 19:02
5F：→ bluecsky:你的问题是在於为何应该掉一段insert出来却没掉吗? 05/25 19:03
6F：→ bluecsky:而且plasmid 7.5k直接跑的话应该会比7k还低欧 05/25 19:03
7F：→ bluecsky:最有可能就是你拿到的map跟你的plasmid不合 05/25 19:04
8F：→ bluecsky:所以你的plasmid已经有修改过了 可能接过什麽东西 05/25 19:04
9F：推 conective:要不要去定序看看 05/25 19:27
10F：推 yaliu:感觉是plasmid发生问题，切一刀怎麽可能比原来的大... 05/25 20:01
11F：推 tsubasawolfy:NEB的double digestion有一张buffer表 05/25 20:11
12F：→ tsubasawolfy:上面写要作seq的在分开做sequential就好 05/25 20:12
14F：→ mimique:plasmid是买来的 (novagen) 买来就transform 05/25 22:16
15F：→ mimique:本身是空的 应该没问题 只是因为construct有问题才会check 05/25 22:17
16F：→ mimique:就算linear form会比较高 但应该也不会大於本来分子量吧 05/25 22:18
17F：→ mimique:前面问的是novagen买来的plasmid的情况 下面double 05/25 22:19
18F：→ mimique:digestion用的是另一个实验室里已经有接insert的plasmid 05/25 22:19
19F：→ mimique:怎麽切都切不出insert 後来补文中提的东西才切动@ @ 05/25 22:20
20F：推 FinAPP:现在要切的切位有没有因为之前的clone动到了,RE不能辨识了? 05/25 22:42