作者gugin (陳抽筋)
看板Biotech
標題[求救] cell cycle analysi 結果無法再現
時間Sat May 23 21:41:22 2009
請想教有關cell cycle 分析時遇到的問題
我的實驗是以藥物處理細胞後 將細胞收下染PI
第一次實驗結果可得到一定比例的 G2/M, subG1, G1 和 S phase
但是當以同樣濃度再重複一次後 發現 subG1 的比例大幅提升 , G2/M 比例沒有第一次高
(PS 我所處理的藥物會造成G2/M arrest)
但是在細胞收下前 我有看過顯微鏡
第一次與第二次的死亡細胞比例是差不多的
但是第一次的subG1 約只有3.5 % 第二次則升高到12 %
並且在貼細胞時 第一次與第二次的 cell viability都差不多
因此想請教有經驗的 cell cycle 分析者, 有可能的原因是出在哪裡?
以下是我收細胞的實驗步驟
1. 先把well內的medium 吸出至 tube (run cell cycle 用的塑膠管)
2. 用1ml PBS 洗 well , 再將 PBS 吸出 至 tube
3. 用200 ul trypsine 反應5 min, 37 度西
4. 用tube 內的 medium 中和 well 內的 trypsine, 把細胞 transfer 到同一個tube
5. 離心 2000 rpm , 5 min, 4度西
6. 倒掉 medium
7. 懸浮pellet 加入 2ml 70% 冰酒精, 置於-20度西冰箱1.5 hr
先前爬文有看過 要一邊vortex 一邊緩慢沿著管壁加, 請問原因何在?
又, 我在做此步驟時, 都是把pellet 懸浮後就直接加酒精，並不會特別注意
要緩慢加入， 請問這樣會明顯影響之後的結果嗎？
8. 離心去除酒精 加入PBS 再次離心 (重複兩次)
9. 加入 500ul PI 37度西反應 15 min
在 PI solution 內有 RNAse, 如果RNA 沒有被去除乾淨, 請問會有什麼影響嗎?
以上是我的問題與實驗步驟
卡了好久 實驗一直無法穩定再現 請高手指點
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 218.167.191.164
1F：推 Seal13:RNA 也可能被PI嵌入...另外你收細胞的動作也可能影響 05/23 22:33
2F：→ Seal13:你只做兩次 還是重複多次得到的趨勢 ? 05/23 22:33
3F：→ Seal13:緩慢滴入酒精 為使固定效果能均勻 05/23 22:35
4F：→ Seal13:你可以先修正實驗操作 再比較和你先前做的有何不同 05/23 22:36
5F：→ gugin:請問收細胞的動作是指? 因為不知道自己是不是沒注意到哪些 05/24 00:22
6F：→ gugin:重要的細節 05/24 00:22
7F：推 tsubasawolfy:沒加triton 100 0.0? 05/24 01:15
8F：→ gugin:有加 triton 100 哦 05/24 08:20
9F：推 kyokolove:覺得是細胞本身的問題 看顯微鏡看不出來差異啦 05/25 23:57
10F：→ kyokolove:乾脆重新解凍新細胞再做 05/25 23:57
11F：推 yinshuang:第一次和第二次的細胞述相同嗎?滿度呢?這些都會影響 06/01 20:17
12F：→ yinshuang:cell cycle ,但還是要看細胞的種類 06/01 20:18