作者gugin (陈抽筋)
看板Biotech
标题[求救] cell cycle analysi 结果无法再现
时间Sat May 23 21:41:22 2009
请想教有关cell cycle 分析时遇到的问题
我的实验是以药物处理细胞後 将细胞收下染PI
第一次实验结果可得到一定比例的 G2/M, subG1, G1 和 S phase
但是当以同样浓度再重复一次後 发现 subG1 的比例大幅提升 , G2/M 比例没有第一次高
(PS 我所处理的药物会造成G2/M arrest)
但是在细胞收下前 我有看过显微镜
第一次与第二次的死亡细胞比例是差不多的
但是第一次的subG1 约只有3.5 % 第二次则升高到12 %
并且在贴细胞时 第一次与第二次的 cell viability都差不多
因此想请教有经验的 cell cycle 分析者, 有可能的原因是出在哪里?
以下是我收细胞的实验步骤
1. 先把well内的medium 吸出至 tube (run cell cycle 用的塑胶管)
2. 用1ml PBS 洗 well , 再将 PBS 吸出 至 tube
3. 用200 ul trypsine 反应5 min, 37 度西
4. 用tube 内的 medium 中和 well 内的 trypsine, 把细胞 transfer 到同一个tube
5. 离心 2000 rpm , 5 min, 4度西
6. 倒掉 medium
7. 悬浮pellet 加入 2ml 70% 冰酒精, 置於-20度西冰箱1.5 hr
先前爬文有看过 要一边vortex 一边缓慢沿着管壁加, 请问原因何在?
又, 我在做此步骤时, 都是把pellet 悬浮後就直接加酒精，并不会特别注意
要缓慢加入， 请问这样会明显影响之後的结果吗？
8. 离心去除酒精 加入PBS 再次离心 (重复两次)
9. 加入 500ul PI 37度西反应 15 min
在 PI solution 内有 RNAse, 如果RNA 没有被去除乾净, 请问会有什麽影响吗?
以上是我的问题与实验步骤
卡了好久 实验一直无法稳定再现 请高手指点
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 218.167.191.164
1F：推 Seal13:RNA 也可能被PI嵌入...另外你收细胞的动作也可能影响 05/23 22:33
2F：→ Seal13:你只做两次 还是重复多次得到的趋势 ? 05/23 22:33
3F：→ Seal13:缓慢滴入酒精 为使固定效果能均匀 05/23 22:35
4F：→ Seal13:你可以先修正实验操作 再比较和你先前做的有何不同 05/23 22:36
5F：→ gugin:请问收细胞的动作是指? 因为不知道自己是不是没注意到哪些 05/24 00:22
6F：→ gugin:重要的细节 05/24 00:22
7F：推 tsubasawolfy:没加triton 100 0.0? 05/24 01:15
8F：→ gugin:有加 triton 100 哦 05/24 08:20
9F：推 kyokolove:觉得是细胞本身的问题 看显微镜看不出来差异啦 05/25 23:57
10F：→ kyokolove:乾脆重新解冻新细胞再做 05/25 23:57
11F：推 yinshuang:第一次和第二次的细胞述相同吗?满度呢?这些都会影响 06/01 20:17
12F：→ yinshuang:cell cycle ,但还是要看细胞的种类 06/01 20:18