作者kotenka (Egg Dance)
看板Biotech
標題[求救] 免疫螢光
時間Mon May 18 20:52:23 2009
各位好，我是已經四個月沒有data的研究生...
目前主要是以HSV感染小鼠之後觀察皮膚的病理變化
在以H&E看組織變化，以及IHC確認HSV protein在皮膚的表現之後
下一步老師要我repeat已畢業學姐的實驗
確認在皮膚出現的infiltrating cell是什麼樣的細胞
使用的方法是免疫螢光染色，大概的步驟如下：
1. 從-80度取出slide，解凍15分鐘
2. 由於染的都是surface marker(CD3 or Gr-1等等)
所以我都是用ice cold acetone fix(可以順便permeablize)
(如果是染intracellular molecule我會用PFA fix再用Triton permeablize)
3. PBS wash之後10% serum blocking 30 mins
4. 加入primary antibody(in 2% serum)在4度C染overnight
5. PBS wash之後加fluorochrome-conjugated secondary Ab(in 2% serum)
室溫30分鐘
6. PBS wash，Hoechst 33342 stain
然後染了四個月什麼都染不到
antibody做過titration了，也試過用PFA fix
也有拿direct-labeled primary Ab，一樣染不到
老師說會不會是我切完片之後沒保存好，所以antigen都degrade了
要我切完片就先沾一下acetone做quick fixation，也染不到
也試過不同厚度的section (5, 10, 20 micron)，染不到...
用IHC也染不到
我的positive control是lymph node和spleen的section，都染不到orz
學姊是畢業前兩個月突然想染什麼就染到什麼，老師也說簡直是miracle
但老師很確定那些data是真的，我也應該要染到
阿，不過真的很frustrated
不知道有沒有人能夠提供意見或一起討論呢
目前沒有把抗體出問題列入考量，因為染了三種marker都染不到(CD3,Gr-1,H597)
先說聲謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 DFS:顯微鏡會不會出包? 05/18 21:54
2F：→ kotenka:應該是不會啦，共用儀器每天都有人用 05/18 21:59
3F：推 ordinary07:二抗的問題? 避光? mounting(anti-fade)? 05/18 22:06
4F：推 DFS:那二抗? 然後一抗? 與學姐的步驟是否一樣? 05/18 22:07
5F：→ kotenka:有避光。有使用螢光用的mouting medium。因為照學姊的步驟 05/18 23:54
6F：→ kotenka:染不出來，所以後來才又做很多修正，但一樣染不出來。 05/18 23:55
7F：→ kotenka:不能排除二抗有問題，但我用direct-labeled一抗也染不到 05/18 23:55
8F：推 DFS:1st Ab. 確定是抓老鼠的? 05/19 00:21
9F：→ kotenka:是的，都是學姊用過的抗體，datasheet我也確認過很多次。 05/19 00:23
10F：→ leoblack:抗體壞掉?!近期抗體也有人一起使用,且做得出來嘛? 05/19 02:11
11F：→ kotenka:是不排除啦，但我很不想接受三隻抗體同時壞掉這個事實orz 05/19 02:25
12F：推 oplz:try 10% TCA 15min on ice for sample fixation and perm. 05/19 08:55
13F：推 oplz:and/or skip the blocking step. 05/19 08:58
14F：推 changyaowen:check一下 抗體能否辦認fixation過的epitope 05/19 10:09
15F：推 dirge:不要用serum做blocking 換2~4%的BSA試試 06/03 02:00
16F：→ dirge:不過在你確定抗體跟螢光系統沒有問題之後再試 06/03 02:02