作者kotenka (Egg Dance)
看板Biotech
标题[求救] 免疫萤光
时间Mon May 18 20:52:23 2009
各位好，我是已经四个月没有data的研究生...
目前主要是以HSV感染小鼠之後观察皮肤的病理变化
在以H&E看组织变化，以及IHC确认HSV protein在皮肤的表现之後
下一步老师要我repeat已毕业学姐的实验
确认在皮肤出现的infiltrating cell是什麽样的细胞
使用的方法是免疫萤光染色，大概的步骤如下：
1. 从-80度取出slide，解冻15分钟
2. 由於染的都是surface marker(CD3 or Gr-1等等)
所以我都是用ice cold acetone fix(可以顺便permeablize)
(如果是染intracellular molecule我会用PFA fix再用Triton permeablize)
3. PBS wash之後10% serum blocking 30 mins
4. 加入primary antibody(in 2% serum)在4度C染overnight
5. PBS wash之後加fluorochrome-conjugated secondary Ab(in 2% serum)
室温30分钟
6. PBS wash，Hoechst 33342 stain
然後染了四个月什麽都染不到
antibody做过titration了，也试过用PFA fix
也有拿direct-labeled primary Ab，一样染不到
老师说会不会是我切完片之後没保存好，所以antigen都degrade了
要我切完片就先沾一下acetone做quick fixation，也染不到
也试过不同厚度的section (5, 10, 20 micron)，染不到...
用IHC也染不到
我的positive control是lymph node和spleen的section，都染不到orz
学姊是毕业前两个月突然想染什麽就染到什麽，老师也说简直是miracle
但老师很确定那些data是真的，我也应该要染到
阿，不过真的很frustrated
不知道有没有人能够提供意见或一起讨论呢
目前没有把抗体出问题列入考量，因为染了三种marker都染不到(CD3,Gr-1,H597)
先说声谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 DFS:显微镜会不会出包? 05/18 21:54
2F：→ kotenka:应该是不会啦，共用仪器每天都有人用 05/18 21:59
3F：推 ordinary07:二抗的问题? 避光? mounting(anti-fade)? 05/18 22:06
4F：推 DFS:那二抗? 然後一抗? 与学姐的步骤是否一样? 05/18 22:07
5F：→ kotenka:有避光。有使用萤光用的mouting medium。因为照学姊的步骤 05/18 23:54
6F：→ kotenka:染不出来，所以後来才又做很多修正，但一样染不出来。 05/18 23:55
7F：→ kotenka:不能排除二抗有问题，但我用direct-labeled一抗也染不到 05/18 23:55
8F：推 DFS:1st Ab. 确定是抓老鼠的? 05/19 00:21
9F：→ kotenka:是的，都是学姊用过的抗体，datasheet我也确认过很多次。 05/19 00:23
10F：→ leoblack:抗体坏掉?!近期抗体也有人一起使用,且做得出来嘛? 05/19 02:11
11F：→ kotenka:是不排除啦，但我很不想接受三只抗体同时坏掉这个事实orz 05/19 02:25
12F：推 oplz:try 10% TCA 15min on ice for sample fixation and perm. 05/19 08:55
13F：推 oplz:and/or skip the blocking step. 05/19 08:58
14F：推 changyaowen:check一下 抗体能否办认fixation过的epitope 05/19 10:09
15F：推 dirge:不要用serum做blocking 换2~4%的BSA试试 06/03 02:00
16F：→ dirge:不过在你确定抗体跟萤光系统没有问题之後再试 06/03 02:02