小弟最近要做in vitro transcription 因為RNA要打入embryo 所以用的Kit會讓做出來的RNA帶有Cap 比較不容易被degrade template是pCS2-GFP GFP前面加上我的insert 在insert的前面有Sp6 promoter construct有送定序確定是我要的 在抽出質體後以NotI切成線性DNA 用phenol/chloroform把DNA純化出來 protocol如下: 加入與含有DNA溶液相同體積的phenol/chloroform/IAA(25:24:1) 將水層吸到乾淨的離心管 加入等體積的chloroform 離心5 mins 再將水層轉移到乾淨離心管 加入1/10體積的NaOAc(3M,pH=5.3) 混合均勻後再加入2倍體積的100% ice EtOH(有先放在冰上讓溫度降低) 於-20。C靜置30 mins後 離心去除上清液 以75%EtOH wash 離心去除EtOH 之後放在Hood讓殘留的EtOH蒸發掉(約1~1.5hrs) 之後加入20ul的DEPC-H2O回溶 取1ul run 1% gel 附圖: http://album.blog.yam.com/show.php?a=fivewood&f=6082378&i=8383106&p=1 左邊是未切的plasmid 右邊是切過的 切過的linear form DNA會跑的比circular form還要慢 之後取6ul的linear DNA做in vitro transcription 因為那組加cap的kit一個reaction要800元 所以我先用一般的protocol先試試看能否做出RNA 比例如下: 5X transcription buffer 4ul 100mM DTT 2ul 10mM dNTP 2ul SP6 RNA polymerase 2ul linear DNA 6ul DEPC-H20 4ul ------------------------------------ 20ul 以37。C反應2~3hr 取1ul run 1%gel check 問題來了 當我跑完膠後 理論上我的RNA大小應該是1kb左右 可是我只能看到我的template而已 做了三次都一樣 RNA就是做不出來 圖:http://album.blog.yam.com/show.php?a=fivewood&f=6082378&i=8382973&p=0 本來以為是EtOH殘留影響酵素活性 可是第三次我特地讓DNA乾燥1.5hr 確定沒有EtOH殘留後才回溶 結果還是一樣=.= 請問有人可以指點迷津嗎?? 感激不盡 --

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