小弟最近要做in vitro transcription 因为RNA要打入embryo 所以用的Kit会让做出来的RNA带有Cap 比较不容易被degrade template是pCS2-GFP GFP前面加上我的insert 在insert的前面有Sp6 promoter construct有送定序确定是我要的 在抽出质体後以NotI切成线性DNA 用phenol/chloroform把DNA纯化出来 protocol如下: 加入与含有DNA溶液相同体积的phenol/chloroform/IAA(25:24:1) 将水层吸到乾净的离心管 加入等体积的chloroform 离心5 mins 再将水层转移到乾净离心管 加入1/10体积的NaOAc(3M,pH=5.3) 混合均匀後再加入2倍体积的100% ice EtOH(有先放在冰上让温度降低) 於-20。C静置30 mins後 离心去除上清液 以75%EtOH wash 离心去除EtOH 之後放在Hood让残留的EtOH蒸发掉(约1~1.5hrs) 之後加入20ul的DEPC-H2O回溶 取1ul run 1% gel 附图: http://album.blog.yam.com/show.php?a=fivewood&f=6082378&i=8383106&p=1 左边是未切的plasmid 右边是切过的 切过的linear form DNA会跑的比circular form还要慢 之後取6ul的linear DNA做in vitro transcription 因为那组加cap的kit一个reaction要800元 所以我先用一般的protocol先试试看能否做出RNA 比例如下: 5X transcription buffer 4ul 100mM DTT 2ul 10mM dNTP 2ul SP6 RNA polymerase 2ul linear DNA 6ul DEPC-H20 4ul ------------------------------------ 20ul 以37。C反应2~3hr 取1ul run 1%gel check 问题来了 当我跑完胶後 理论上我的RNA大小应该是1kb左右 可是我只能看到我的template而已 做了三次都一样 RNA就是做不出来 图:http://album.blog.yam.com/show.php?a=fivewood&f=6082378&i=8382973&p=0 本来以为是EtOH残留影响酵素活性 可是第三次我特地让DNA乾燥1.5hr 确定没有EtOH残留後才回溶 结果还是一样=.= 请问有人可以指点迷津吗?? 感激不尽 --

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