作者gikilin ()
看板Biotech
標題[求救] 關於transwell的實驗~新手做不出來
時間Fri May 15 14:17:54 2009
最近實驗室在做有關cancer cell line的migration實驗
由於實驗室是第一次做~
只能自己找paper或其他論文的實驗步驟設計
統合了一下大家的實驗方法～自己做了一次...可是卻大失敗!
可以問一下我的過程哪裡有問題嗎？><希望做過的人可以幫忙一下
我使用的是BD 24-well 8um
step.
1.cell count，取細胞約5*10^3 至transwell
2.bottom well 加入500 ul DMEM medium FBS 10% as chemoattractant
☆也有考慮用fibronectin，但第一次做先用SERUM濃度當chemoattractant
3.incubactor 37℃ 14hr-18hr。
4.將transwell拿起，其內之細胞培養液吸掉
5.將上層未migration的細胞刮除
△這邊我大有疑問...可以請教一下各位都怎麼將上層細胞刮乾淨嗎？
之前課堂上有請教一位學姊，學姊說用PBS沖掉，
我有問說這樣會不會連migration至另外一面的cell都沖走，她說不會。
6.用1X PBS wash上層細胞。
7.加入適當的stain solution至新well，再將transwell置入染色
(40% methanol、10%glacial acetic acid.0.1%coomasie blue)至新的well，
將transwell放入，利用顯微鏡觀察染色狀況以調整染色時間。
9.加入destain solution至退去背景即可（依經驗調整時間）
10.在顯微鏡下計數細胞
★這裡不懂大家都怎麼計數細胞??？
本來用夾子把membrane撕下..結果撕到一半就有悲劇發生QQ
membrane變很皺 又有撕痕 ><
而且在顯微鏡下..竟然沒看到什麼細胞..
是我在第6步wash時，就把下層的細胞也沖掉了嗎？
這邊還有一個問題～細胞會穿過membrane到下層well? 算下層well的細胞數？
還是算membrane下層的細胞數呢？
一整個很傷心的實驗結果
因為第一次做也沒有人教
希望做過的人可以幫一下我解惑
非常感謝您!
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O°。oｏ○相簿裡面都是泡泡○ｏo。°O
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.228
1F：推 tsubasawolfy:拿棉花棒擦上層0.0 05/15 14:24
2F：推 soom:同上 我們家會用hoechst染色後直接把Insert拿去算 05/15 14:27
3F：→ gikilin:需要將棉花抽掉或是如何嗎？我看過有人說要將棉花抽散？ 05/15 15:02
4F：→ gikilin:謝謝你們的回答～那我的步驟有問題嗎？ 05/15 15:02
5F：推 tyh0104:要買比較有肉的棉花棒 再把它捏軟~ 05/15 21:37
6F：→ tyh0104:另外 細胞數夠嗎? 細胞數跟時間都要try~ 05/15 21:40
8F：推 cetuspower:抱歉用錯.. 05/15 23:51