作者gikilin ()
看板Biotech
标题[求救] 关於transwell的实验~新手做不出来
时间Fri May 15 14:17:54 2009
最近实验室在做有关cancer cell line的migration实验
由於实验室是第一次做~
只能自己找paper或其他论文的实验步骤设计
统合了一下大家的实验方法～自己做了一次...可是却大失败!
可以问一下我的过程哪里有问题吗？><希望做过的人可以帮忙一下
我使用的是BD 24-well 8um
step.
1.cell count，取细胞约5*10^3 至transwell
2.bottom well 加入500 ul DMEM medium FBS 10% as chemoattractant
☆也有考虑用fibronectin，但第一次做先用SERUM浓度当chemoattractant
3.incubactor 37℃ 14hr-18hr。
4.将transwell拿起，其内之细胞培养液吸掉
5.将上层未migration的细胞刮除
△这边我大有疑问...可以请教一下各位都怎麽将上层细胞刮乾净吗？
之前课堂上有请教一位学姊，学姊说用PBS冲掉，
我有问说这样会不会连migration至另外一面的cell都冲走，她说不会。
6.用1X PBS wash上层细胞。
7.加入适当的stain solution至新well，再将transwell置入染色
(40% methanol、10%glacial acetic acid.0.1%coomasie blue)至新的well，
将transwell放入，利用显微镜观察染色状况以调整染色时间。
9.加入destain solution至退去背景即可（依经验调整时间）
10.在显微镜下计数细胞
★这里不懂大家都怎麽计数细胞??？
本来用夹子把membrane撕下..结果撕到一半就有悲剧发生QQ
membrane变很皱 又有撕痕 ><
而且在显微镜下..竟然没看到什麽细胞..
是我在第6步wash时，就把下层的细胞也冲掉了吗？
这边还有一个问题～细胞会穿过membrane到下层well? 算下层well的细胞数？
还是算membrane下层的细胞数呢？
一整个很伤心的实验结果
因为第一次做也没有人教
希望做过的人可以帮一下我解惑
非常感谢您!
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O°。oｏ○相簿里面都是泡泡○ｏo。°O
http://www.wretch.cc/album/gikilin
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.228
1F：推 tsubasawolfy:拿棉花棒擦上层0.0 05/15 14:24
2F：推 soom:同上 我们家会用hoechst染色後直接把Insert拿去算 05/15 14:27
3F：→ gikilin:需要将棉花抽掉或是如何吗？我看过有人说要将棉花抽散？ 05/15 15:02
4F：→ gikilin:谢谢你们的回答～那我的步骤有问题吗？ 05/15 15:02
5F：推 tyh0104:要买比较有肉的棉花棒 再把它捏软~ 05/15 21:37
6F：→ tyh0104:另外 细胞数够吗? 细胞数跟时间都要try~ 05/15 21:40
8F：推 cetuspower:抱歉用错.. 05/15 23:51