作者loham (無色)
看板Biotech
標題[求救] Western的band不在正確的位置上
時間Thu May 14 13:28:45 2009
因為已經重做到快發瘋了,希望板上好心的大家救我
我要看的protein是mmp-1,52kDa
一開始做一抗用1:1000都跑不出band來,曝光很久也沒有,背景變很黑
之後改成1:400,可以看到一點點band,出現在43kDa~55kDa的位置(比較靠近55)
之後我把膠跑的比較久,讓它們跑開一點(43~55差了1.5公分)
因為要同時看actin所以我通常都會從43~55中間剪開(剪的位置稍微靠近43,大概是1:2)
結果剪到actin的上緣(actin比43kDa的marker約高了0.5公分)
學姐跟我說我要以actin為準來看蛋白的位置
讓我很頭痛
因為55kDa的marker下面0.4公分的地方有很模糊的band
0.3公分的地方有更淡更淡的band
55kDa上方0.3公分的地方也有一條更清楚的band
可是我的抗體是同時可以看mmp-1跟mmp-8(52kDa跟65kDa)
所以現在我根本不知道哪一條才是正確的
而且我之前做marker也不會不準,但是我沒有跑那麼開過
marker是Fermentas的0671,protein煮7分鐘
以下是示意圖 拜託大家救救我〒△〒
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55 │—﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍ │
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╠═▂▂▂▂▂▂▂▂▂═╣←剪開
43 │— │
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◆ From: 140.128.64.100
1F：推 bigcat24:可以考慮不剪 先做目標蛋白 再STRIP 換看actin 05/14 13:46
2F：推 DFS:我也遇到同樣的問題... 05/14 14:19
3F：→ DFS:用0671這支marker來對b-actin 位置總是會游超過43kD... 05/14 14:21
4F：推 chvkimo:我是認為差不多 應該就可以了吧 marker大小也不一定準 05/14 19:27
5F：→ chvkimo:我看我的0671 的說明書 也不是43 而是40kD,所以大小不會差 05/14 19:28
6F：→ chvkimo:太多就可以了 05/14 19:28
7F：推 chvkimo:提供給你參考 05/14 22:05
8F：推 bluecsky:那個..SDS PAGE的band位置跟marker不會完全準 05/14 22:32
9F：→ bluecsky:那個東西看相對就好 不要差到太大就可接受 05/14 22:32
10F：→ loham:感謝大家 我下週要重做了 唉~ 05/16 16:14
11F：推 ranilla:GAPDH保證在43kd下 05/18 00:09