作者loham (无色)
看板Biotech
标题[求救] Western的band不在正确的位置上
时间Thu May 14 13:28:45 2009
因为已经重做到快发疯了,希望板上好心的大家救我
我要看的protein是mmp-1,52kDa
一开始做一抗用1:1000都跑不出band来,曝光很久也没有,背景变很黑
之後改成1:400,可以看到一点点band,出现在43kDa~55kDa的位置(比较靠近55)
之後我把胶跑的比较久,让它们跑开一点(43~55差了1.5公分)
因为要同时看actin所以我通常都会从43~55中间剪开(剪的位置稍微靠近43,大概是1:2)
结果剪到actin的上缘(actin比43kDa的marker约高了0.5公分)
学姐跟我说我要以actin为准来看蛋白的位置
让我很头痛
因为55kDa的marker下面0.4公分的地方有很模糊的band
0.3公分的地方有更淡更淡的band
55kDa上方0.3公分的地方也有一条更清楚的band
可是我的抗体是同时可以看mmp-1跟mmp-8(52kDa跟65kDa)
所以现在我根本不知道哪一条才是正确的
而且我之前做marker也不会不准,但是我没有跑那麽开过
marker是Fermentas的0671,protein煮7分钟
以下是示意图 拜托大家救救我〒△〒
┌───────────┐
│ │
│ ╴╴╴╴╴╴╴╴╴ │
55 │—﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍ │
│ ﹊﹊﹊﹊﹊﹊﹊﹊﹊ │
╠═▂▂▂▂▂▂▂▂▂═╣←剪开
43 │— │
│ │
└───────────┘
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.64.100
1F：推 bigcat24:可以考虑不剪 先做目标蛋白 再STRIP 换看actin 05/14 13:46
2F：推 DFS:我也遇到同样的问题... 05/14 14:19
3F：→ DFS:用0671这支marker来对b-actin 位置总是会游超过43kD... 05/14 14:21
4F：推 chvkimo:我是认为差不多 应该就可以了吧 marker大小也不一定准 05/14 19:27
5F：→ chvkimo:我看我的0671 的说明书 也不是43 而是40kD,所以大小不会差 05/14 19:28
6F：→ chvkimo:太多就可以了 05/14 19:28
7F：推 chvkimo:提供给你参考 05/14 22:05
8F：推 bluecsky:那个..SDS PAGE的band位置跟marker不会完全准 05/14 22:32
9F：→ bluecsky:那个东西看相对就好 不要差到太大就可接受 05/14 22:32
10F：→ loham:感谢大家 我下周要重做了 唉~ 05/16 16:14
11F：推 ranilla:GAPDH保证在43kd下 05/18 00:09