作者davideason (Davideason)
看板Biotech
標題Re: [求救] ligation怎麼接都接不出來
時間Mon May 11 14:37:26 2009
PCR cycles 數有點高 不過跟您的問題 相關性比較小
Invitrogen 的白金牌 Taq 應該只是準確性高的 Taq
沒有 proof reading (應該巴~大叔懶得查了)
這隻Taq 也不需要另外加其他的Taq 即可用來作 TA
所以
我猜問題是出在 competent cell
可能您用的那種因為insert 太大轉進去 cell的效率就很差
解決方式 要馬 作作 heat shock > 馬上插冰上 > 塗盤
結果 我猜 應該會改善
或者 建議您去買 RBC 出的 HIT Competent Cell (我們家 是跟惠眾買一隻80)
DNA 加一加不用 heat shock 就可以塗盤了
一整個好用
老實說 insert 3K 真的還好~ 我還比較害怕 80-90bp的小片段
祝您實驗順利
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.52.139
1F：推 micocat:RBC是益生的離職員工做的 05/11 19:54
2F：→ micocat:簡單說技術是偷益生的 效率應該是差不多 05/11 19:55
3F：推 blence:兩家都買過,但HIT品管不好,有混到帶抗藥性菌株 05/11 20:26
4F：→ davideason:挖賽~還有這層關係喔~anyway~樓上可以跟我透露混到哪種 05/12 09:45
5F：→ davideason:抗性的細菌嗎~大叔我最近操作gateway系統發現一些怪象 05/12 09:46
6F：→ davideason:雖然都能順利解決~不過也是有點懷疑是不是勝住細胞 05/12 09:49
7F：→ davideason:因為在Spec的篩選下~有些透明的colony根本P不到抽不到 05/12 09:52
8F：→ davideason:plasmid(我操作的是3.5K native promoter+ORF) 05/12 09:53
9F：→ davideason:不過那也是在 LR反應之後 , 所以 很難說是什麼原因 05/12 09:54
10F：推 greendeer:E. coli受不了大量表現，都死光了，所以你都挑不到 05/13 21:58
11F：→ greendeer:當然這要你的2K片段是基因，然後somehow自己轉譯了... 05/13 21:59