作者davideason (Davideason)
看板Biotech
标题Re: [求救] ligation怎麽接都接不出来
时间Mon May 11 14:37:26 2009
PCR cycles 数有点高 不过跟您的问题 相关性比较小
Invitrogen 的白金牌 Taq 应该只是准确性高的 Taq
没有 proof reading (应该巴~大叔懒得查了)
这只Taq 也不需要另外加其他的Taq 即可用来作 TA
所以
我猜问题是出在 competent cell
可能您用的那种因为insert 太大转进去 cell的效率就很差
解决方式 要马 作作 heat shock > 马上插冰上 > 涂盘
结果 我猜 应该会改善
或者 建议您去买 RBC 出的 HIT Competent Cell (我们家 是跟惠众买一只80)
DNA 加一加不用 heat shock 就可以涂盘了
一整个好用
老实说 insert 3K 真的还好~ 我还比较害怕 80-90bp的小片段
祝您实验顺利
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.52.139
1F：推 micocat:RBC是益生的离职员工做的 05/11 19:54
2F：→ micocat:简单说技术是偷益生的 效率应该是差不多 05/11 19:55
3F：推 blence:两家都买过,但HIT品管不好,有混到带抗药性菌株 05/11 20:26
4F：→ davideason:挖赛~还有这层关系喔~anyway~楼上可以跟我透露混到哪种 05/12 09:45
5F：→ davideason:抗性的细菌吗~大叔我最近操作gateway系统发现一些怪象 05/12 09:46
6F：→ davideason:虽然都能顺利解决~不过也是有点怀疑是不是胜住细胞 05/12 09:49
7F：→ davideason:因为在Spec的筛选下~有些透明的colony根本P不到抽不到 05/12 09:52
8F：→ davideason:plasmid(我操作的是3.5K native promoter+ORF) 05/12 09:53
9F：→ davideason:不过那也是在 LR反应之後 , 所以 很难说是什麽原因 05/12 09:54
10F：推 greendeer:E. coli受不了大量表现，都死光了，所以你都挑不到 05/13 21:58
11F：→ greendeer:当然这要你的2K片段是基因，然後somehow自己转译了... 05/13 21:59