作者raxjimmy (rearrangement)
看板Biotech
標題[求救] 抽完RNA之後的電泳圖很扯
時間Sun May 10 22:30:09 2009
1%agarose電泳
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=raxjimmy&b=13&f=1728006415&p=0
我用TAE buffer 100V 15min (參考版友)
box我有用很毒的DEPC水(未滅菌)混酒精75%先處理過
TAE是用之前配的50X稀釋 只是這樣好像不算現配就是了
lane1 lamda phage 用HindIII處理
lane3&4 沒有用玻璃珠直接磨
lane5&6 加入玻璃珠磨
最後沉澱的量都差不多 都用20ul回溶
不過有兩個問題
第一個是ISP沉澱物看起來不夠透明 白白的
而且回溶也出現一點問題 不完全溶 而會留下一些纖維絲狀物
第二個問題是我加了ISP之後因為對於不vortex的步驟突然產生疑惑
於是就給他粗魯的攪動了......
不過攪動之前我看ISP和trizol抽出的粉紅上清中間出現沉澱
這樣就是正常嗎? 還是其實一開始應該讓ISP跟trizol均質?
最後這樣的結果是我取10ul跑的 才這樣的亮度= =|||
260/280很糟 出現小於1就算了 還有0.1的
其實過程中發現很多步驟很不好處理的
比如說我用mortar處理完的sample一拿離開mortar
就會吸水氣變的很黏很難弄到eppendorf
最後回溶之後我才開始做aga膠 所以在冰上放了一下才跑電泳
不過如果中間步驟和器材都沒有污染的話
那這個圖是什麼意思 全滅了嗎= = 也沒拖尾 濃度低 分子量又小
跑的比bromophenol blue還快也太瞎了吧
所以是中間有污染摟?
第一次做 沒有一個部分跟我預期的一樣XD 真是一頭霧水
我用剩下的sample裝在50ml的離心試管 然後丟到液態氮桶
明天應該會再拿出來做一次
暫時只能想到步驟重複 然後ISP那裡不要搖晃 就照著protocol放10min然後離心
然後跑電泳測UV之後再比較
不過UV那個應該很明顯我抽失敗吧...
額外一問 配3%雙氧水可以買藥房的來稀釋嗎
經費問題 而且老闆對雙氧水實在不怎麼感興趣 所以我想自己去買一瓶配
畢竟是我在吸嘛XD
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.13.115.38
1F：推 bluecsky:260/280這麼低表示你protein沒去乾淨 不完全算是汙染 05/11 08:53
2F：→ bluecsky:但是原本細胞中的protein也沒分離乾淨 裡面可能很多RNase 05/11 08:54
3F：→ bluecsky:看你那band 應該是被分解光了 剩下的碎片RNA 05/11 08:55
4F：推 sGoat:話說他有用力搖XDD... 05/11 09:01
5F：→ raxjimmy:可是加ISP之後分層很明顯阿= = 不均質一下會沉澱嗎? 05/11 17:20
6F：→ raxjimmy:而且蛋白質沒分掉是因為我sample下太多嗎? 05/11 17:34
7F：推 sGoat:要均質啦,上下顛倒幾次就好了,不要大力搖... 05/12 00:42
8F：→ sGoat:蛋白質沒分掉可能是你分層時吸到雜質... 05/12 00:43
9F：推 zoom8080:恩 寧願犧牲掉一點不吸，另外ISP太久 protein也會變性而 05/12 03:04
10F：→ zoom8080:沉澱下來 05/12 03:04
11F：→ zoom8080:ISP怎麼會跟粉紅色的一起? 第一歩不是加氯仿嗎? 05/12 03:06
12F：→ raxjimmy:加氯訪離心之後的上清也是粉紅阿XD 05/12 08:58
13F：→ raxjimmy:昨天做了第二次還是一樣 囧 打算重新取組織再做一次 05/12 09:00
14F：推 sGoat:組織我記得有建議量,不要取超量...RNA電泳正常有2個明顯band 05/12 10:12
15F：→ sGoat:TAE gel分離效果不是那麼好... 05/12 10:13
16F：推 Ice9:1% agarose gel(TAE) 分 1.8k 和 4.7k 的 rRNA 足夠了。 05/13 01:24
17F：→ Ice9:OD 0.1 orz 會不會是有些酒精賴著不走了。 05/13 01:25
18F：→ raxjimmy:有可能 我沒有放到完全乾就回溶了 因為pellet完全透明.. 05/13 07:48