作者raxjimmy (rearrangement)
看板Biotech
标题[求救] 抽完RNA之後的电泳图很扯
时间Sun May 10 22:30:09 2009
1%agarose电泳
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=raxjimmy&b=13&f=1728006415&p=0
我用TAE buffer 100V 15min (参考版友)
box我有用很毒的DEPC水(未灭菌)混酒精75%先处理过
TAE是用之前配的50X稀释 只是这样好像不算现配就是了
lane1 lamda phage 用HindIII处理
lane3&4 没有用玻璃珠直接磨
lane5&6 加入玻璃珠磨
最後沉淀的量都差不多 都用20ul回溶
不过有两个问题
第一个是ISP沉淀物看起来不够透明 白白的
而且回溶也出现一点问题 不完全溶 而会留下一些纤维丝状物
第二个问题是我加了ISP之後因为对於不vortex的步骤突然产生疑惑
於是就给他粗鲁的搅动了......
不过搅动之前我看ISP和trizol抽出的粉红上清中间出现沉淀
这样就是正常吗? 还是其实一开始应该让ISP跟trizol均质?
最後这样的结果是我取10ul跑的 才这样的亮度= =|||
260/280很糟 出现小於1就算了 还有0.1的
其实过程中发现很多步骤很不好处理的
比如说我用mortar处理完的sample一拿离开mortar
就会吸水气变的很黏很难弄到eppendorf
最後回溶之後我才开始做aga胶 所以在冰上放了一下才跑电泳
不过如果中间步骤和器材都没有污染的话
那这个图是什麽意思 全灭了吗= = 也没拖尾 浓度低 分子量又小
跑的比bromophenol blue还快也太瞎了吧
所以是中间有污染搂?
第一次做 没有一个部分跟我预期的一样XD 真是一头雾水
我用剩下的sample装在50ml的离心试管 然後丢到液态氮桶
明天应该会再拿出来做一次
暂时只能想到步骤重复 然後ISP那里不要摇晃 就照着protocol放10min然後离心
然後跑电泳测UV之後再比较
不过UV那个应该很明显我抽失败吧...
额外一问 配3%双氧水可以买药房的来稀释吗
经费问题 而且老板对双氧水实在不怎麽感兴趣 所以我想自己去买一瓶配
毕竟是我在吸嘛XD
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.13.115.38
1F：推 bluecsky:260/280这麽低表示你protein没去乾净 不完全算是污染 05/11 08:53
2F：→ bluecsky:但是原本细胞中的protein也没分离乾净 里面可能很多RNase 05/11 08:54
3F：→ bluecsky:看你那band 应该是被分解光了 剩下的碎片RNA 05/11 08:55
4F：推 sGoat:话说他有用力摇XDD... 05/11 09:01
5F：→ raxjimmy:可是加ISP之後分层很明显阿= = 不均质一下会沉淀吗? 05/11 17:20
6F：→ raxjimmy:而且蛋白质没分掉是因为我sample下太多吗? 05/11 17:34
7F：推 sGoat:要均质啦,上下颠倒几次就好了,不要大力摇... 05/12 00:42
8F：→ sGoat:蛋白质没分掉可能是你分层时吸到杂质... 05/12 00:43
9F：推 zoom8080:恩 宁愿牺牲掉一点不吸，另外ISP太久 protein也会变性而 05/12 03:04
10F：→ zoom8080:沉淀下来 05/12 03:04
11F：→ zoom8080:ISP怎麽会跟粉红色的一起? 第一歩不是加氯仿吗? 05/12 03:06
12F：→ raxjimmy:加氯访离心之後的上清也是粉红阿XD 05/12 08:58
13F：→ raxjimmy:昨天做了第二次还是一样 囧 打算重新取组织再做一次 05/12 09:00
14F：推 sGoat:组织我记得有建议量,不要取超量...RNA电泳正常有2个明显band 05/12 10:12
15F：→ sGoat:TAE gel分离效果不是那麽好... 05/12 10:13
16F：推 Ice9:1% agarose gel(TAE) 分 1.8k 和 4.7k 的 rRNA 足够了。 05/13 01:24
17F：→ Ice9:OD 0.1 orz 会不会是有些酒精赖着不走了。 05/13 01:25
18F：→ raxjimmy:有可能 我没有放到完全乾就回溶了 因为pellet完全透明.. 05/13 07:48