※ 引述《a89824704 (wen)》之銘言： : 你ligation的時間是多長 你有看data shit說明insert片段多長時ligation的時間要多久你可以試試insert的片段量加多一點 或是ligation量多一點 : ※ 引述《ayuba ()》之銘言： : 我的insert大小2kb要接到pGEMT Easy(3kb)裡 : PCR用的Taq是invitrogen的Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity : PCR的condition是94 2min : 94 30sec --- : 55 30sec |- 35cycles : 68 2min --- : 72 15min : ligation condition: : insert 3uL : vector 1uL : ligase 1uL : 2Xbuffer 5uL : 很奇怪的是用此kit做1kb以內的product一樣接到pGEMTE裡就接的起來 : 但很奇怪2kb怎麼接就接不起來，PCR也重做過很多次 : 雖然此組Taq具有pfu的能力，他也同時添加了一般的Taq，根據我們老師的說法 : 在cycle完後加上72度C 10分鐘即可讓一般Taq working 做A tailing的動作 : 600~800bp的沒問題，2k這個怎麼接都接不起來，我一度還懷疑是product太長導致A tail : 無法完全，因此72度加長到15分但結果還是一樣 A tail是加在二端 跟product長度應該汲關係 : 但我們老師以前這個pcr kit clone過2.9k的product 所以照理說應該不是kit的問題 : 用一般的Taq無Pfu也做過一次，結果還是相同 : 說一下結果的情況好了，transform前會加100mL LB or SOC recover 1hr@200rpm : 藍白篩的結果白菌的數量通常比藍色少，colony都沒有很大 : 通常是只要有白色就全挑 : 如果ligation成功，用EcoRI去切完跑電泳vector的band會比insert亮 : 600~800bp做出來是這樣沒錯； digest 完全的情況下 vector跟insert的莫耳數是一樣的 (個數一樣多) 而vector是3k insert 0.6~0.8k 所以vector"重量" 比insert 大 有比較多 minor groove 染出來比較亮是理所當然的 : 但2k的那組切出來也有2K左右及3K的band可是 : 2kb band位置會往上shift，且2Kb左右的band會比3kb的亮，所以ligation不成功 請問 3k 的 band 有shift 嗎 如果你是抽plasmid 來做digest 那這條多出來的band 從哪來的就很有趣了 你可以用 T7, SP6 primer 夾夾看是否有 insert 或是抽出來的plasmid 單切一刀 看vector size是多少 這二個方法都可以確認insert是否有接進去 : 簡單的TA cloning為什麼會變得這麼困難 : 有人會懷疑可能buffer壞了，promega我們買了已經有3組也有另外單獨買buffer : 新送來就馬上做也是做不出來，competent cell也是用益生的YE607 : ================================以上是TA cloning=================================== : 另外一個是insert(2K)用ApaI/BamHI切出，vector(4K)也是用ApaI/BamHI切出我要的 : ApaI是用25度切4 hour再用BamH37度切4 hour，用的是NEB的酵素 : vector取20ug；insert取30ug下去切想說這樣應該夠濃了吧 : 切完跑電泳check大小皆正確，切膠再用QIA的kit去extract : 為了算比例還特地會去測濃度在算molar ratio比例1:3下去做 : 用過很多種ligation kit，沒有一次transform是有長半顆的... : transform前會加5倍體積LB recovery 1hr 都有菌生成 : 但塗了plate後不會長就是不會長 : 已經卡關卡了半年了，做到都快煩死了...希望有經驗的人來指引一條光明的路 : 我們樓上的實驗室也是在做clone，情況也是跟我們差不多，我們兩間都是新的老師 : 新實驗室，我老師跟他們老師也都有親自下廚做過也是一樣不是沒長半顆不然就是切出來 : 大小不對，還一度想說是不是要來拜拜一下，做到發瘋了 > <||| --

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