※ 引述《a89824704 (wen)》之铭言： : 你ligation的时间是多长 你有看data shit说明insert片段多长时ligation的时间要多久你可以试试insert的片段量加多一点 或是ligation量多一点 : ※ 引述《ayuba ()》之铭言： : 我的insert大小2kb要接到pGEMT Easy(3kb)里 : PCR用的Taq是invitrogen的Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity : PCR的condition是94 2min : 94 30sec --- : 55 30sec |- 35cycles : 68 2min --- : 72 15min : ligation condition: : insert 3uL : vector 1uL : ligase 1uL : 2Xbuffer 5uL : 很奇怪的是用此kit做1kb以内的product一样接到pGEMTE里就接的起来 : 但很奇怪2kb怎麽接就接不起来，PCR也重做过很多次 : 虽然此组Taq具有pfu的能力，他也同时添加了一般的Taq，根据我们老师的说法 : 在cycle完後加上72度C 10分钟即可让一般Taq working 做A tailing的动作 : 600~800bp的没问题，2k这个怎麽接都接不起来，我一度还怀疑是product太长导致A tail : 无法完全，因此72度加长到15分但结果还是一样 A tail是加在二端 跟product长度应该汲关系 : 但我们老师以前这个pcr kit clone过2.9k的product 所以照理说应该不是kit的问题 : 用一般的Taq无Pfu也做过一次，结果还是相同 : 说一下结果的情况好了，transform前会加100mL LB or SOC recover 1hr@200rpm : 蓝白筛的结果白菌的数量通常比蓝色少，colony都没有很大 : 通常是只要有白色就全挑 : 如果ligation成功，用EcoRI去切完跑电泳vector的band会比insert亮 : 600~800bp做出来是这样没错； digest 完全的情况下 vector跟insert的莫耳数是一样的 (个数一样多) 而vector是3k insert 0.6~0.8k 所以vector"重量" 比insert 大 有比较多 minor groove 染出来比较亮是理所当然的 : 但2k的那组切出来也有2K左右及3K的band可是 : 2kb band位置会往上shift，且2Kb左右的band会比3kb的亮，所以ligation不成功 请问 3k 的 band 有shift 吗 如果你是抽plasmid 来做digest 那这条多出来的band 从哪来的就很有趣了 你可以用 T7, SP6 primer 夹夹看是否有 insert 或是抽出来的plasmid 单切一刀 看vector size是多少 这二个方法都可以确认insert是否有接进去 : 简单的TA cloning为什麽会变得这麽困难 : 有人会怀疑可能buffer坏了，promega我们买了已经有3组也有另外单独买buffer : 新送来就马上做也是做不出来，competent cell也是用益生的YE607 : ================================以上是TA cloning=================================== : 另外一个是insert(2K)用ApaI/BamHI切出，vector(4K)也是用ApaI/BamHI切出我要的 : ApaI是用25度切4 hour再用BamH37度切4 hour，用的是NEB的酵素 : vector取20ug；insert取30ug下去切想说这样应该够浓了吧 : 切完跑电泳check大小皆正确，切胶再用QIA的kit去extract : 为了算比例还特地会去测浓度在算molar ratio比例1:3下去做 : 用过很多种ligation kit，没有一次transform是有长半颗的... : transform前会加5倍体积LB recovery 1hr 都有菌生成 : 但涂了plate後不会长就是不会长 : 已经卡关卡了半年了，做到都快烦死了...希望有经验的人来指引一条光明的路 : 我们楼上的实验室也是在做clone，情况也是跟我们差不多，我们两间都是新的老师 : 新实验室，我老师跟他们老师也都有亲自下厨做过也是一样不是没长半颗不然就是切出来 : 大小不对，还一度想说是不是要来拜拜一下，做到发疯了 > <||| --

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