作者egoweaver (Hiko)
看板Biotech
標題[求救] Recombinant protein和預期的大小不一致
時間Thu May 7 20:03:34 2009
最近在做recombinant protein，primer夾的序列translation之後預期的大小是18.5KDa
表現質體用pET30a，restriction enzyme用BamHI/EcoRI從已定序沒有錯誤的TA vector
subclone進去，再用restriction enzyme切割跑膠確定有insert。
之後transform到BL21(DE3)裡面表現。
在pET裡表現出來預期是~26KDa。
可是出來的產物，直接拿crude lysate去跑SDS page卻看到產物在~34KDa的地方，而且用
Ni column沒有辦法純化出來(東西全都在flow through)。
因為primer是之前在實驗室的學姊設計的，所以回頭檢查是不是open reading frame出
問題，但是沒出錯。
學姊之前也是做到這一步卡住，產物也是在34KDa……
同樣的insert也subclone到pGEX裡，但是大小和預期一致，只是在inclusion body裡純化
不出來。
兩個問題：
1.有什麼原因會讓蛋白比預期還大嗎？或者那根本就不是我的蛋白(但是induction之後確
實是多出那條band……)
2.純化不出來跟我一開始沒過filter就進column有關係嗎(學長說這樣column就報廢了 囧)
內容很亂，請多包涵……
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即使消失也無妨全部重新開始也無所謂封上的心情與溫暖的肌膚令人無法理解而混沌不明是
可以替 很久以來我已遺忘天使與魔鬼在耳邊的低語 代的接納自己的焦躁與醜惡是無與倫比
的美麗但是誰來需要我吧害怕受到傷害其實我感受得到除了這一切一切以外你的存在我相信
心情變差了希望有誰來束縛我信任你擁有 所剩的不過是兩肩上灰色的黯淡人影 羞惡之心與
尊嚴拒絕一直這樣下去於是更為恐懼無比的希望下一個破壞差異與隔閡分辨善惡之能力智慧
與機巧然後走向夢 絮絮聒聒的要我如何如何罷了 與風的彼側來吧即使我的世界因此破碎。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 yaliu:借個地方問一下，為什麼算出來轉譯後預期的大小和在pET表現 05/07 22:24
2F：→ yaliu:預期的大小會不同阿？？？ 05/07 22:25
因為加上tag和一些有的沒的……restriction enzyme切位還有給protease切掉tag的部分
大概會多8KDa左右吧(pET)
3F：→ yaliu:有時候prestain的marker不是很準，特別是小片段的差很多 05/07 22:26
我也這麼覺得，可是實驗室裡其他人做出來的pET都不會多這麼多啊\囧/(而且很少有人做
到比預期還大的……)
4F：推 littlelizard:醣基化嗎? 要不要預測一下有無醣基化位置? 05/07 22:34
5F：→ littlelizard:或者做個醣蛋白染色 05/07 22:35
E.coli表現應該不會做glycosylation?
6F：→ littlelizard:要過0.45 um 比較好喔 不然卡在膠裡洗不掉 05/07 22:36
受教了@@ 我上次忘記過(抖)
7F：→ littlelizard:可參考 GE Healthcare 的純化 HandBook 05/07 22:41
※ 編輯: egoweaver 來自: 140.112.244.194 (05/08 00:37)
8F：推 nzj:如果眼睛看沒雜質 拿去通column沒有那麼容易壞 05/10 00:58