作者egoweaver (Hiko)
看板Biotech
标题[求救] Recombinant protein和预期的大小不一致
时间Thu May 7 20:03:34 2009
最近在做recombinant protein，primer夹的序列translation之後预期的大小是18.5KDa
表现质体用pET30a，restriction enzyme用BamHI/EcoRI从已定序没有错误的TA vector
subclone进去，再用restriction enzyme切割跑胶确定有insert。
之後transform到BL21(DE3)里面表现。
在pET里表现出来预期是~26KDa。
可是出来的产物，直接拿crude lysate去跑SDS page却看到产物在~34KDa的地方，而且用
Ni column没有办法纯化出来(东西全都在flow through)。
因为primer是之前在实验室的学姊设计的，所以回头检查是不是open reading frame出
问题，但是没出错。
学姊之前也是做到这一步卡住，产物也是在34KDa……
同样的insert也subclone到pGEX里，但是大小和预期一致，只是在inclusion body里纯化
不出来。
两个问题：
1.有什麽原因会让蛋白比预期还大吗？或者那根本就不是我的蛋白(但是induction之後确
实是多出那条band……)
2.纯化不出来跟我一开始没过filter就进column有关系吗(学长说这样column就报废了 囧)
内容很乱，请多包涵……
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即使消失也无妨全部重新开始也无所谓封上的心情与温暖的肌肤令人无法理解而混沌不明是
可以替 很久以来我已遗忘天使与魔鬼在耳边的低语 代的接纳自己的焦躁与丑恶是无与伦比
的美丽但是谁来需要我吧害怕受到伤害其实我感受得到除了这一切一切以外你的存在我相信
心情变差了希望有谁来束缚我信任你拥有 所剩的不过是两肩上灰色的黯淡人影 羞恶之心与
尊严拒绝一直这样下去於是更为恐惧无比的希望下一个破坏差异与隔阂分辨善恶之能力智慧
与机巧然後走向梦 絮絮聒聒的要我如何如何罢了 与风的彼侧来吧即使我的世界因此破碎。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 yaliu:借个地方问一下，为什麽算出来转译後预期的大小和在pET表现 05/07 22:24
2F：→ yaliu:预期的大小会不同阿？？？ 05/07 22:25
因为加上tag和一些有的没的……restriction enzyme切位还有给protease切掉tag的部分
大概会多8KDa左右吧(pET)
3F：→ yaliu:有时候prestain的marker不是很准，特别是小片段的差很多 05/07 22:26
我也这麽觉得，可是实验室里其他人做出来的pET都不会多这麽多啊\囧/(而且很少有人做
到比预期还大的……)
4F：推 littlelizard:醣基化吗? 要不要预测一下有无醣基化位置? 05/07 22:34
5F：→ littlelizard:或者做个醣蛋白染色 05/07 22:35
E.coli表现应该不会做glycosylation?
6F：→ littlelizard:要过0.45 um 比较好喔 不然卡在胶里洗不掉 05/07 22:36
受教了@@ 我上次忘记过(抖)
7F：→ littlelizard:可参考 GE Healthcare 的纯化 HandBook 05/07 22:41
※ 编辑: egoweaver 来自: 140.112.244.194 (05/08 00:37)
8F：推 nzj:如果眼睛看没杂质 拿去通column没有那麽容易坏 05/10 00:58