作者sjacky (陳小文)
看板Biotech
標題[求救] 有關Western Blotting(附圖)
時間Tue May 5 19:08:00 2009
最近每天都在作Western Blotting
發現有時會出現一些問題
圖在
http://0rz.tw/C0ZS3
有問題的地方用紅色圈圈起來
每次壓片後，發現總是有某些地方都是空白
我們有用Magic Marker，連Marker壓出來也都怪怪的
補上實驗步驟
1. 7.5% or 10% SDS-PAGE
2. Sample與sample buffer比例1：1的混合
3. 混合後置於乾浴機105℃-110℃中10分鐘，再置於冰上冷卻
4. 以65V進行電泳，直到tracking dye跑至膠體底部
5. 將SDS PAGE取出，裁切適當大小後，置於Gel buffer中10-15分鐘(100
rpm)、NC mambrane置於ddH2O、3M paper置於blottting buffer潤濕
6. 半乾濕（Bio-Rad）Transfer 18V 1小時：a.3M paper b.PVDF c.SDS-PAGE
d.3M paper
7. Transfer後，將mambrane置於blocking buffer中室溫1小時
8. 以Washing buffer washing mambrane 3次，每次5分鐘
9. 一級抗體在4℃ o/n
10.利用Washing buffer清洗mambrane 3次，每次10分鐘
11.二級抗體在室溫1小時
12.利用Washing buffer清洗mambrane 5次，每次3分鐘
13.混合Substrate（Millipore）進行壓片
麻煩請大家幫我看看是哪邊出問題！謝謝
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◆ From: 61.64.22.9
※ 編輯: sjacky 來自: 61.64.22.9 (05/05 19:08)
1F：推 bf:有空氣嗎? 05/05 19:22
2F：→ sjacky:沒有耶，有氣泡頂多也是小點點，不太可能一大塊 ＠＠ 05/05 19:31
3F：→ sjacky:我也重複趕過很多次，基本上，不太可能有氣泡 05/05 19:32
※ 編輯: sjacky 來自: 61.64.22.9 (05/05 19:34)
4F：推 angelhunter:ECL在membrance上加一點再蓋起來試試看 05/05 19:35
5F：→ sjacky:我加入的ECL共400ul，足以完全覆蓋mambrane，並作用30秒後 05/05 19:57
6F：→ sjacky:才壓片 05/05 19:57
7F：→ sjacky:我也都有重複壓片，並延長時間，結果都差不多 >"< 05/05 19:58
8F：推 tsubasawolfy:transfer的問題XD 而且你缺的都是在右下角 05/05 19:58
9F：→ tsubasawolfy:另一片是在右上 不過我覺得是擺的位置不同差異 05/05 19:58
10F：→ tsubasawolfy:跟別人借transfer機器看看 05/05 19:59
11F：→ sjacky:嗯，我們討論也是猜測transfer出問題，不過也有別人用同樣 05/05 20:07
12F：→ sjacky:的機器，但是他做出來的就很漂亮，機器沒有異常 05/05 20:09
13F：→ sjacky:莫非是我手殘...... 05/05 20:09
14F：推 tsubasawolfy:下次你transfer完後把膠拿去染看看 05/05 20:15
15F：→ sjacky:明天打算染膠和染壓片後的mambrane，在看看結果如何 05/05 20:34
16F：→ sjacky:不知道蛋白殘留在mambrane和轉過去mambrane有多少蛋白 05/05 20:35
17F：推 ptk:是NC還是PVDF 05/05 22:16
18F：→ sjacky:NC 05/05 22:25
19F：推 chvkimo:我懷疑是transfer夾子鬆掉, 可以多墊張海棉~~ 05/06 00:30
20F：推 alaric:你不適合用semi-dry, 換用濕式的吧.. 05/06 01:48
21F：推 chvkimo:沒看到 原來是用semi-dry喔 我眼殘 呵呵 05/06 02:53
22F：推 hurp:Transfer的問題.把3M紙上下都加到4張.疊好之後,用剪短的 05/06 13:42
23F：→ hurp:的pippet在上頭輕輕滾動,壓跑氣泡順便把所有東西略為壓緊, 05/06 13:43
24F：→ hurp:並確定transfer的電極板有放好.然後blocking和probe的過程,要 05/06 13:44
25F：→ hurp:確定溶液有泡得很均勻.這樣子應該就不會空白的地方了 05/06 13:45
26F：→ sjacky:嗯，我今天transfer的時候，有特別注意，明天做完看看結果 05/06 19:41
27F：推 chvkimo:加油 等你的好消息 這樣也可以增加經驗勒 05/07 01:33