作者sjacky (陈小文)
看板Biotech
标题[求救] 有关Western Blotting(附图)
时间Tue May 5 19:08:00 2009
最近每天都在作Western Blotting
发现有时会出现一些问题
图在
http://0rz.tw/C0ZS3
有问题的地方用红色圈圈起来
每次压片後，发现总是有某些地方都是空白
我们有用Magic Marker，连Marker压出来也都怪怪的
补上实验步骤
1. 7.5% or 10% SDS-PAGE
2. Sample与sample buffer比例1：1的混合
3. 混合後置於乾浴机105℃-110℃中10分钟，再置於冰上冷却
4. 以65V进行电泳，直到tracking dye跑至胶体底部
5. 将SDS PAGE取出，裁切适当大小後，置於Gel buffer中10-15分钟(100
rpm)、NC mambrane置於ddH2O、3M paper置於blottting buffer润湿
6. 半乾湿（Bio-Rad）Transfer 18V 1小时：a.3M paper b.PVDF c.SDS-PAGE
d.3M paper
7. Transfer後，将mambrane置於blocking buffer中室温1小时
8. 以Washing buffer washing mambrane 3次，每次5分钟
9. 一级抗体在4℃ o/n
10.利用Washing buffer清洗mambrane 3次，每次10分钟
11.二级抗体在室温1小时
12.利用Washing buffer清洗mambrane 5次，每次3分钟
13.混合Substrate（Millipore）进行压片
麻烦请大家帮我看看是哪边出问题！谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.22.9
※ 编辑: sjacky 来自: 61.64.22.9 (05/05 19:08)
1F：推 bf:有空气吗? 05/05 19:22
2F：→ sjacky:没有耶，有气泡顶多也是小点点，不太可能一大块 ＠＠ 05/05 19:31
3F：→ sjacky:我也重复赶过很多次，基本上，不太可能有气泡 05/05 19:32
※ 编辑: sjacky 来自: 61.64.22.9 (05/05 19:34)
4F：推 angelhunter:ECL在membrance上加一点再盖起来试试看 05/05 19:35
5F：→ sjacky:我加入的ECL共400ul，足以完全覆盖mambrane，并作用30秒後 05/05 19:57
6F：→ sjacky:才压片 05/05 19:57
7F：→ sjacky:我也都有重复压片，并延长时间，结果都差不多 >"< 05/05 19:58
8F：推 tsubasawolfy:transfer的问题XD 而且你缺的都是在右下角 05/05 19:58
9F：→ tsubasawolfy:另一片是在右上 不过我觉得是摆的位置不同差异 05/05 19:58
10F：→ tsubasawolfy:跟别人借transfer机器看看 05/05 19:59
11F：→ sjacky:嗯，我们讨论也是猜测transfer出问题，不过也有别人用同样 05/05 20:07
12F：→ sjacky:的机器，但是他做出来的就很漂亮，机器没有异常 05/05 20:09
13F：→ sjacky:莫非是我手残...... 05/05 20:09
14F：推 tsubasawolfy:下次你transfer完後把胶拿去染看看 05/05 20:15
15F：→ sjacky:明天打算染胶和染压片後的mambrane，在看看结果如何 05/05 20:34
16F：→ sjacky:不知道蛋白残留在mambrane和转过去mambrane有多少蛋白 05/05 20:35
17F：推 ptk:是NC还是PVDF 05/05 22:16
18F：→ sjacky:NC 05/05 22:25
19F：推 chvkimo:我怀疑是transfer夹子松掉, 可以多垫张海棉~~ 05/06 00:30
20F：推 alaric:你不适合用semi-dry, 换用湿式的吧.. 05/06 01:48
21F：推 chvkimo:没看到 原来是用semi-dry喔 我眼残 呵呵 05/06 02:53
22F：推 hurp:Transfer的问题.把3M纸上下都加到4张.叠好之後,用剪短的 05/06 13:42
23F：→ hurp:的pippet在上头轻轻滚动,压跑气泡顺便把所有东西略为压紧, 05/06 13:43
24F：→ hurp:并确定transfer的电极板有放好.然後blocking和probe的过程,要 05/06 13:44
25F：→ hurp:确定溶液有泡得很均匀.这样子应该就不会空白的地方了 05/06 13:45
26F：→ sjacky:嗯，我今天transfer的时候，有特别注意，明天做完看看结果 05/06 19:41
27F：推 chvkimo:加油 等你的好消息 这样也可以增加经验勒 05/07 01:33