作者moliugam (絕代狂華)
看板Biotech
標題[求救] 大片段的ligation !?
時間Fri May 1 10:28:19 2009
我所使用的載體是pcDNA3 (invitrogen)
其實片段說大也不是很大 想要ligation的片段大小大約1000 bp而已
但是這個載體我之前有先接上另一個基因，基因片段是2200 bp左右
所以使得原本5.4 kbp的pcDNA3載體大小變成了7600 bp
現在的實驗就是想要把這1000 bp的基因ligation到這7600 bp的載體中
最後預計產生的載體大小將近10 kbp
我用的RE site是EcoRV (NEB)，會產生平端的切位
切完的vector有使用Antarctic phosphatase移除磷酸根
RE使用的DNA量為 5 ug
截切 overnight
截切後切膠純化，並測定回收後的DNA濃度
ligation所使用的DNA總量為100 ng
分三個不同insert vector比 1:1 3:1 7:1
ligation用的水是DEPC水
ligation的條件有使用 常溫2hrs (protocol建議平端ligation條件)
4度 overnight
16度 overnight
經過transform JM109後，完全沒有colony產生 囧"
compontent cell 測試是OK的
想請問我還可以在哪些步驟修改方法的
想順便請問pcDNA3最大可以接受多少的insert
有在考慮是不是因為insert太大做不出來，或是ligation後的vector太大不好transform
麻煩大家了 orzzz
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.59.235
1F：推 hchs890843:ligation有做個pos ctrl嗎:) 05/01 10:31
2F：→ hchs890843:前幾天也做了一個快10k的plasmid, 不過我用的是sticky 05/01 10:31
3F：→ hchs890843:看到上面才想到, 要做個recovery這樣中獎機率才高:D 05/01 10:33
4F：→ moliugam:有 postive ctrl 沒問題 這就是很詭異的地方了 囧" 05/01 10:36
5F：推 bluecsky:用DEPC水 囧 真高級...可以試者把insert再多一些看看 05/01 12:06
6F：→ bluecsky:還有你有沒有確認過ligase的活性?ligase buffer是否能用 05/01 12:06
7F：→ bluecsky:我沒用過pcDNA3 不過我之前做過另一種construct 05/01 12:07
8F：→ bluecsky:原本5.7k先加上3.5k的gene後 再加上1.5k的gene 05/01 12:07
9F：→ bluecsky:還是可以成功 所以我覺得大小不是很大的問題 05/01 12:08
10F：→ bluecsky:transform我也是用heat-shock 很怕效率不夠可以考慮用 05/01 12:08
11F：→ bluecsky:電轉的...總之我覺得你那大小還好而已 05/01 12:10
12F：→ bluecsky:話說那個好像只是一週前做的事 XD... 05/01 12:10
13F：→ moliugam:ligase是最近新買的 ligation 只有切EcoRV的pcDNA3沒問題 05/01 13:46
14F：→ moliugam:所以buffer應該也是OK的 05/01 13:46
15F：→ moliugam:不知道我還有什麼條件沒有想到的，哀，卡關卡很大 05/01 13:47
16F：推 shaline:據我所知DEPC水是用來溶RNA的，pH值偏酸，不知道會不會影 05/01 15:00
17F：→ shaline:響enzyme activity.... 05/01 15:01
18F：推 bluecsky:shaline提的也有可能歐 你要不要換一般滅菌水做看看? 05/01 16:57
19F：→ moliugam:OK 這點我最近會做一下實驗 謝謝 XD 05/01 17:36