作者moliugam (绝代狂华)
看板Biotech
标题[求救] 大片段的ligation !?
时间Fri May 1 10:28:19 2009
我所使用的载体是pcDNA3 (invitrogen)
其实片段说大也不是很大 想要ligation的片段大小大约1000 bp而已
但是这个载体我之前有先接上另一个基因，基因片段是2200 bp左右
所以使得原本5.4 kbp的pcDNA3载体大小变成了7600 bp
现在的实验就是想要把这1000 bp的基因ligation到这7600 bp的载体中
最後预计产生的载体大小将近10 kbp
我用的RE site是EcoRV (NEB)，会产生平端的切位
切完的vector有使用Antarctic phosphatase移除磷酸根
RE使用的DNA量为 5 ug
截切 overnight
截切後切胶纯化，并测定回收後的DNA浓度
ligation所使用的DNA总量为100 ng
分三个不同insert vector比 1:1 3:1 7:1
ligation用的水是DEPC水
ligation的条件有使用 常温2hrs (protocol建议平端ligation条件)
4度 overnight
16度 overnight
经过transform JM109後，完全没有colony产生 囧"
compontent cell 测试是OK的
想请问我还可以在哪些步骤修改方法的
想顺便请问pcDNA3最大可以接受多少的insert
有在考虑是不是因为insert太大做不出来，或是ligation後的vector太大不好transform
麻烦大家了 orzzz
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.59.235
1F：推 hchs890843:ligation有做个pos ctrl吗:) 05/01 10:31
2F：→ hchs890843:前几天也做了一个快10k的plasmid, 不过我用的是sticky 05/01 10:31
3F：→ hchs890843:看到上面才想到, 要做个recovery这样中奖机率才高:D 05/01 10:33
4F：→ moliugam:有 postive ctrl 没问题 这就是很诡异的地方了 囧" 05/01 10:36
5F：推 bluecsky:用DEPC水 囧 真高级...可以试者把insert再多一些看看 05/01 12:06
6F：→ bluecsky:还有你有没有确认过ligase的活性?ligase buffer是否能用 05/01 12:06
7F：→ bluecsky:我没用过pcDNA3 不过我之前做过另一种construct 05/01 12:07
8F：→ bluecsky:原本5.7k先加上3.5k的gene後 再加上1.5k的gene 05/01 12:07
9F：→ bluecsky:还是可以成功 所以我觉得大小不是很大的问题 05/01 12:08
10F：→ bluecsky:transform我也是用heat-shock 很怕效率不够可以考虑用 05/01 12:08
11F：→ bluecsky:电转的...总之我觉得你那大小还好而已 05/01 12:10
12F：→ bluecsky:话说那个好像只是一周前做的事 XD... 05/01 12:10
13F：→ moliugam:ligase是最近新买的 ligation 只有切EcoRV的pcDNA3没问题 05/01 13:46
14F：→ moliugam:所以buffer应该也是OK的 05/01 13:46
15F：→ moliugam:不知道我还有什麽条件没有想到的，哀，卡关卡很大 05/01 13:47
16F：推 shaline:据我所知DEPC水是用来溶RNA的，pH值偏酸，不知道会不会影 05/01 15:00
17F：→ shaline:响enzyme activity.... 05/01 15:01
18F：推 bluecsky:shaline提的也有可能欧 你要不要换一般灭菌水做看看? 05/01 16:57
19F：→ moliugam:OK 这点我最近会做一下实验 谢谢 XD 05/01 17:36