作者relaxsleep (火球連發~)
看板Biotech
標題[求救]transformation不進去?
時間Fri May 1 09:36:28 2009
我要送一個質體大小是7.5kb+0.2kb
切位是ClaI and BamHI
載體(7.5kb)截切6小時以上後 有做CIP處理切膠純化
insert(0.2kb)是PCR產物在primer上設計切位 截切1小時切膠純化
16度ligase overnight後
使用YE607勝任細胞做轉殖
先冰15分鐘 42度45秒 再冰15分鐘後塗PLATE
但幾乎都沒有colone產生
不然就是長出來的是原始的載体?
請問是轉殖效率太低 改用YE609 ?
或是質體沒接上的關西?
做了10幾次了>"<...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.109
1F：推 ranilla:heat shock完，一般不是37度recovery 30-6o mins? 05/01 09:47
2F：→ ranilla:200b.p的片段，純化要小心column是否有辦法有效留住 05/01 09:49
3F：→ relaxsleep:我是照他的protocal做的 純化我使用kit也有跑膠確認 05/01 09:52
4F：→ relaxsleep:應該有留住band很濃 05/01 09:53
5F：推 bluecsky:你沒有recovery...除非你的comptent cell效率超高.. 05/01 09:53
6F：→ bluecsky:要不然這樣大多都不會太好... 05/01 09:54
7F：→ bluecsky:唯一用過不recovery的就是跟廠商買的那種超高效率的XD 05/01 09:54
8F：→ relaxsleep:好 我試看看 謝謝! 05/01 09:54
9F：→ relaxsleep:我的是跟廠商買的耶...不過是經濟型的 會差很多嗎? 05/01 09:55
10F：→ bluecsky:heat shock完 加入一些LB medium 放37度一小時 05/01 09:55
11F：→ bluecsky:我跟廠商買的那種是..室溫vortex 1秒就能轉成功的歐XD 05/01 09:56
12F：→ relaxsleep:那還真強 是益生的嗎? 05/01 09:58
13F：推 bluecsky:忘了= =...好久以前了 後來都自己做 05/01 09:59
14F：→ relaxsleep:恩謝謝~ 以前送比較小的質體都很好送 現在這比較大的都 05/01 10:07
15F：→ relaxsleep:很難接 都做10幾次才能接上>"< 05/01 10:07
16F：推 turtle24:我剛學做clone用的是十幾Kb的 = = 做了半年才送進去 05/01 10:23
17F：→ relaxsleep:@@~~你的勝任細胞是買的嗎? 半年..我也接一年了 05/01 10:26
18F：→ relaxsleep:做完的要送到Aspergillus niger還轉不進去 05/01 10:27
19F：推 turtle24:我是接學姐的繼續做 所以加起來也是一年= = 最後沒表現 05/01 11:22
20F：推 yaliu:primer酵素切點左右有預留幾個mer吧？heat shock完冰15分會 05/01 12:20
21F：→ yaliu:不會太久阿...我只冰2分鐘而已耶 05/01 12:20
22F：→ yaliu:冰完加LB養30分鐘以上 05/01 12:20
23F：→ relaxsleep:primer旁邊有加4個mer 冰的時間有關係喔? 05/01 12:44
24F：推 shaline:NEB舊的catalog有說限制酵素切點外要多加2-3mer，並切>16h 05/01 14:44
25F：→ shaline:才有>90% efficiency，再加上你的colony都是vector only， 05/01 14:48
26F：→ shaline:極度有可能是insert沒切好，接不進去。Try it! 05/01 14:48
27F：推 kirby0415:insert沒切好,或是切壞了 05/01 23:58
28F：推 magicaries:RE的end-cutting最好確認一下, 另外, 我是heat shock完 05/02 13:51
29F：→ magicaries:冰5分鐘, 然後加LB 37度搖50分鐘 05/02 13:52