作者relaxsleep (火球连发~)
看板Biotech
标题[求救]transformation不进去?
时间Fri May 1 09:36:28 2009
我要送一个质体大小是7.5kb+0.2kb
切位是ClaI and BamHI
载体(7.5kb)截切6小时以上後 有做CIP处理切胶纯化
insert(0.2kb)是PCR产物在primer上设计切位 截切1小时切胶纯化
16度ligase overnight後
使用YE607胜任细胞做转殖
先冰15分钟 42度45秒 再冰15分钟後涂PLATE
但几乎都没有colone产生
不然就是长出来的是原始的载体?
请问是转殖效率太低 改用YE609 ?
或是质体没接上的关西?
做了10几次了>"<...
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.109
1F：推 ranilla:heat shock完，一般不是37度recovery 30-6o mins? 05/01 09:47
2F：→ ranilla:200b.p的片段，纯化要小心column是否有办法有效留住 05/01 09:49
3F：→ relaxsleep:我是照他的protocal做的 纯化我使用kit也有跑胶确认 05/01 09:52
4F：→ relaxsleep:应该有留住band很浓 05/01 09:53
5F：推 bluecsky:你没有recovery...除非你的comptent cell效率超高.. 05/01 09:53
6F：→ bluecsky:要不然这样大多都不会太好... 05/01 09:54
7F：→ bluecsky:唯一用过不recovery的就是跟厂商买的那种超高效率的XD 05/01 09:54
8F：→ relaxsleep:好 我试看看 谢谢! 05/01 09:54
9F：→ relaxsleep:我的是跟厂商买的耶...不过是经济型的 会差很多吗? 05/01 09:55
10F：→ bluecsky:heat shock完 加入一些LB medium 放37度一小时 05/01 09:55
11F：→ bluecsky:我跟厂商买的那种是..室温vortex 1秒就能转成功的欧XD 05/01 09:56
12F：→ relaxsleep:那还真强 是益生的吗? 05/01 09:58
13F：推 bluecsky:忘了= =...好久以前了 後来都自己做 05/01 09:59
14F：→ relaxsleep:恩谢谢~ 以前送比较小的质体都很好送 现在这比较大的都 05/01 10:07
15F：→ relaxsleep:很难接 都做10几次才能接上>"< 05/01 10:07
16F：推 turtle24:我刚学做clone用的是十几Kb的 = = 做了半年才送进去 05/01 10:23
17F：→ relaxsleep:@@~~你的胜任细胞是买的吗? 半年..我也接一年了 05/01 10:26
18F：→ relaxsleep:做完的要送到Aspergillus niger还转不进去 05/01 10:27
19F：推 turtle24:我是接学姐的继续做 所以加起来也是一年= = 最後没表现 05/01 11:22
20F：推 yaliu:primer酵素切点左右有预留几个mer吧？heat shock完冰15分会 05/01 12:20
21F：→ yaliu:不会太久阿...我只冰2分钟而已耶 05/01 12:20
22F：→ yaliu:冰完加LB养30分钟以上 05/01 12:20
23F：→ relaxsleep:primer旁边有加4个mer 冰的时间有关系喔? 05/01 12:44
24F：推 shaline:NEB旧的catalog有说限制酵素切点外要多加2-3mer，并切>16h 05/01 14:44
25F：→ shaline:才有>90% efficiency，再加上你的colony都是vector only， 05/01 14:48
26F：→ shaline:极度有可能是insert没切好，接不进去。Try it! 05/01 14:48
27F：推 kirby0415:insert没切好,或是切坏了 05/01 23:58
28F：推 magicaries:RE的end-cutting最好确认一下, 另外, 我是heat shock完 05/02 13:51
29F：→ magicaries:冰5分钟, 然後加LB 37度摇50分钟 05/02 13:52